Tha metabolites imdhíon-mhodúlach nam prìomh fheart de mhicro-àrainneachd an tumhair (TME), ach le beagan eisgeachdan, chan eil mòran fiosrachaidh againn fhathast mu na dearbh-aithnean aca. An seo, rinn sinn mion-sgrùdadh air tumhair agus ceallan-T bho na tumhair agus ascites euslaintich le carcinoma serous àrd-ìre (HGSC) gus metabolome nan diofar roinnean TME seo fhoillseachadh. Tha eadar-dhealachaidhean mòra ann am metabolites aig ascites agus ceallan tumhair. An coimeas ri ascites, tha na ceallan-T a tha a’ dol a-steach don tumhair gu math beairteach ann an 1-methylnicotinamide (MNA). Ged a tha ìre MNA ann an ceallan-T àrd, tha abairt nicotinamide N-methyltransferase (enzyme a bhios a’ catalachadh gluasad bhuidhnean methyl bho S-adenosylmethionine gu nicotinamide) cuingealaichte ri fibroblasts agus ceallan tumhair. Gu gnìomhach, bidh MNA a’ toirt air ceallan-T an cytokine factar necrosis tumhair alpha a leigeil ma sgaoil. Mar sin, tha MNA a tha stèidhichte air TME a’ cur ri riaghladh dìonachd cheallan-T agus a’ riochdachadh targaid imdhíon-leigheis a dh’fhaodadh a bhith ann airson aillse daonna a làimhseachadh.
Faodaidh buaidh mhòr bacaidh a bhith aig metabolites a thig bho tumhair air dìonachd an-aghaidh tumhair, agus tha barrachd is barrachd fianais a’ sealltainn gum faod iad cuideachd a bhith nan prìomh fheachd dràibhidh airson adhartas galair (1). A bharrachd air buaidh Warburg, tha obair o chionn ghoirid air tòiseachadh a’ comharrachadh staid metabolach cheallan tumhair agus a’ cheangal a th’ aige ri staid dìonachd meanbh-àrainneachd an tumhair (TME). Tha sgrùdaidhean air modalan luchaige agus ceallan T daonna air sealltainn gum faod metabolism glutamine (2), metabolism oxidative (3) agus metabolism glùcois (4) obrachadh gu neo-eisimeileach air diofar fho-bhuidhnean cealla dìonachd. Tha grunn metabolites anns na slighean sin a’ cur bacadh air gnìomh an-aghaidh tumhair cheallan T. Chaidh a dhearbhadh gum faod bacadh a’ choenzyme tetrahydrobiopterin (BH4) cron a dhèanamh air iomadachadh cheallan T, agus faodaidh àrdachadh BH4 anns a’ bhodhaig am freagairt dìonachd an-aghaidh tumhair a tha air a mheadhanachadh le CD4 agus CD8 a neartachadh. A bharrachd air an sin, faodar buaidh dìonachd-bhacadh kynurenine a shàbhaladh le bhith a’ rianachd BH4 (5). Ann an glioblastoma mutant isocitrate dehydrogenase (IDH), bidh secretion enantiometabolic (R)-2-hydroxyglutarate (R-2-HG) a’ cur bacadh air gnìomhachadh, iomadachadh agus gnìomhachd cytolysis ceallan T (6). O chionn ghoirid, chaidh a shealltainn gu bheil methylglyoxal, fo-thoradh de glycolysis, air a thoirt gu buil le ceallan bacaidh de thùs myeloid, agus faodaidh gluasad ceallan T de methylglyoxal gnìomhachd ceallan T effector a bhacadh. Ann an làimhseachadh, faodaidh neodrachadh methylglyoxal buaidh a thoirt air gnìomhachd cheallan bacaidh a thig bho myeloid (MDSC) agus leigheas bacadh puing-sgrùdaidh a neartachadh gu co-obrachail ann am modalan luchaige (7). Tha na sgrùdaidhean seo gu còmhla a’ cur cuideam air prìomh dhreuchd metabolites a thig bho TME ann a bhith a’ riaghladh gnìomh agus gnìomhachd ceallan T.
Chaidh aithris gu farsaing air mì-ghnìomhachd cheallan-T ann an aillse ubhagach (8). Tha seo gu ìre mar thoradh air na feartan metabolach a tha an lùib hypoxia agus vasculature tumhair neo-àbhaisteach (9), a tha ag adhbhrachadh tionndadh glùcois agus tryptophan gu fo-thoraidhean leithid searbhag lactach agus kynurenine. Bidh cus lactate extracellular a’ lughdachadh cinneasachadh interferon-γ (IFN-γ) agus a’ stiùireadh eadar-dhealachadh fo-bhuidhnean myelosuppressive (10, 11). Bidh caitheamh tryptophan a’ cur bacadh dìreach air iomadachadh cheallan-T agus a’ cur bacadh air comharran gabhadair ceallan-T (12-14). A dh’ aindeoin nan beachdan sin, chaidh tòrr obrach a dhèanamh a thaobh metabolism dìonachd ann an cultar ceallan-T in vitro a’ cleachdadh meadhanan leasaichte, no cuingealaichte ri modalan luchaige homologous in vivo, agus chan eil gin dhiubh sin a’ nochdadh gu h-iomlan neo-chunbhalachd aillsean daonna agus macro agus micro àrainneachd fiseòlasach.
Is e feart cumanta aillse ubhagach sgaoileadh peritoneal agus coltas ascites. Tha cruinneachadh lionn cealla ann an ascites co-cheangailte ri galar adhartach agus droch ro-innse (15). A rèir aithisgean, tha an roinn shònraichte seo hypocsaigeach, tha ìrean àrda de fhactar fàis endothelial vascular (VEGF) agus indoleamine 2,3-dioxygenase (IDO) ann, agus tha ceallan riaghlaidh T agus ceallan bacaidh myeloid a’ dol a-steach ann (15-18). Is dòcha gu bheil àrainneachd metabolach ascites eadar-dhealaichte bho àrainneachd an tumhair fhèin, agus mar sin chan eil ath-phrògramadh cheallan T anns an àite peritoneal soilleir. A bharrachd air an sin, faodaidh na prìomh eadar-dhealachaidhean agus an neo-chunbhalachd eadar ascites agus metabolites a tha an làthair ann an àrainneachd an tumhair bacadh a chur air in-shìoladh cheallan dìon agus an gnìomh air tumhair, agus tha feum air tuilleadh rannsachaidh.
Gus na duilgheadasan sin fhuasgladh, dhealbhaich sinn dòigh speactramaitraidh tomad tandem (LC-MS/MS) airson dealachadh cealla mothachail agus cromatagrafaidheachd leaghaidh gus diofar sheòrsaichean cealla (a’ gabhail a-steach ceallan-T CD4+ agus CD8+) a sgrùdadh a bharrachd air taobh a-staigh agus eadar tumhair. Tha na metabolites aige a’ dol thairis air ceallan san aon àrainneachd ascites agus tumhair ris an euslainteach. Bidh sinn a’ cleachdadh an dòigh seo còmhla ri cytometry sruthadh àrd-thaobhach agus sreath RNA aon-chealla (scRNA-seq) gus dealbh làn-rùnach a thoirt seachad de inbhe metabolach nan sluagh cudromach sin. Nochd an dòigh seo àrdachadh mòr ann an ìre 1-methylnicotinamide (MNA) ann an ceallan-T tumhair, agus sheall deuchainnean in vitro nach robh buaidh immunomodulatory MNA air gnìomhachd ceallan-T aithnichte roimhe. San fharsaingeachd, tha an dòigh seo a’ nochdadh na h-eadar-obrachaidhean metabolach dha chèile eadar tumhair agus ceallan dìonachd, agus a’ toirt sealladh gun samhail air metabolites riaghlaidh dìonachd, a dh’ fhaodadh a bhith feumail airson làimhseachadh immunotherapy aillse ubhagach stèidhichte air ceallan-T. Cothroman làimhseachaidh.
Chleachd sinn cytometry sruthadh àrd-thaobhach gus tomhas a dhèanamh aig an aon àm air glacadh glùcois [2-(N-(7-nitrophenyl-2-oxa-1,3-diaza-4-yl)amino)-2-deoxyglucose (2-NBDG) agus gnìomhachd mitochondrial [MitoTracker Deep Red (MT DR)] (7, 19, 20) nan comharran àbhaisteach taobh ri taobh a tha a’ comharrachadh ceallan dìonachd agus sluagh cheallan tumhair (Clàr S2 agus Figear S1A). Sheall an anailis seo, an taca ri ceallan T, gu bheil ìrean glacaidh glùcois nas àirde aig ceallan ascites agus tumhair, ach gu bheil eadar-dhealachaidhean nas lugha ann an gnìomhachd mitochondrial. Tha an glacadh glùcois cuibheasach de cheallan tumhair [CD45-EpCAM (EpCAM)+] trì no ceithir uiread nas motha na tha aig ceallan T, agus tha an glacadh glùcois cuibheasach de cheallan T CD4 + 1.2 uiread nas motha na tha aig ceallan T CD8 +, a tha a’ nochdadh gu bheil riatanasan metabolach eadar-dhealaichte aig lymphocytes a tha a’ dol a-steach do tumhair (TIL) eadhon san aon TME (Figear 1A). An coimeas ri sin, tha gnìomhachd mitochondrial ann an ceallan tumhair coltach ri gnìomhachd cheallan T CD4 +, agus tha gnìomhachd mitochondrial an dà sheòrsa cealla nas àirde na gnìomhachd cheallan T CD8 + (Figear 1B). San fharsaingeachd, tha na toraidhean seo a’ nochdadh an ìre metabolach. Tha gnìomhachd metabolach cheallan tumhair nas àirde na gnìomhachd cheallan T CD4 +, agus tha gnìomhachd metabolach cheallan T CD4 + nas àirde na gnìomhachd cheallan T CD8 +. A dh’ aindeoin nan buaidhean sin thar sheòrsachan cealla, chan eil eadar-dhealachadh cunbhalach ann an inbhe metabolach cheallan T CD4 + agus CD8 + no na co-mheasan coimeasach aca ann an ascites an taca ri tumhair (Figear 1C). An coimeas ri sin, anns a’ cho-roinn cealla CD45, mheudaich co-mheas cheallan EpCAM + anns an tumhair an taca ri ascites (Figear 1D). Chunnaic sinn cuideachd eadar-dhealachadh metabolach soilleir eadar co-phàirtean cealla EpCAM + agus EpCAM-. Tha gabhail glùcois agus gnìomhachd mitochondrial nas àirde aig ceallan EpCAM + (tumhair) na ceallan EpCAM-, a tha mòran nas àirde na gnìomhachd metabolach fibroblasts ann an ceallan tumhair ann an TME (Figear 1, E agus F).
(A agus B) Meadhan dian fluorescence (MFI) de ghlacadh glùcois (2-NBDG) (A) agus gnìomhachd mitochondrial de cheallan T CD4 + (MitoTracker dearg dorcha) (B) Grafaichean riochdachail (clì) agus dàta clàraichte (Deas), ceallan T CD8 + agus ceallan tumhair EpCAM + CD45 bho ascites agus tumhair. (C) Co-mheas cheallan CD4 + agus CD8 + (de cheallan T CD3 +) ann an ascites agus tumhair. (D) Co-mheas cheallan tumhair EpCAM + ann an ascites agus tumhair (CD45−). (E agus F) Glacadh glùcois EpCAM + CD45-tumhair agus EpCAM-CD45-matrix (2-NBDG) (E) agus gnìomhachd mitochondrial (MitoTracker dearg dorcha) (F) grafaichean riochdachail (clì) agus dàta clàraichte (Deas) Ceallan ascites agus tumhair. (G) Grafaichean riochdachail de abairt CD25, CD137 agus PD1 le cytometry sruthadh. (H agus I) Abairteachadh CD25, CD137 agus PD1 air ceallan-T CD4+ (H) agus ceallan-T CD8+ (I). (J agus K) Fenotipean naive, cuimhne meadhanach (Tcm), èifeachdach (Teff) agus cuimhne èifeachdach (Tem) stèidhichte air abairteachadh CCR7 agus CD45RO. Ìomhaighean riochdachail (clì) agus dàta clàr (deas) de cheallan-T CD4+ (J) agus ceallan-T CD8+ (K) ann an ascites agus tumhair. Luachan P air an dearbhadh le deuchainn-t càraideach (*P<0.05, **P<0.01 agus ***P<0.001). Tha an loidhne a’ riochdachadh euslaintich a tha co-ionnan (n = 6). FMO, fluorescence minus aon; MFI, dian fluorescence meadhanach.
Nochd tuilleadh mion-sgrùdaidh eadar-dhealachaidhean cudromach eile eadar inbhe phenotypic cealla T a bha air a rèiteachadh gu mòr. Tha an cuimhne ghnìomhaichte (Figear 1, G gu I) agus cuimhne èifeachdach (Figear 1, J agus K) ann an tumhair mòran nas trice na ascites (co-roinn de cheallan T CD3 +). San aon dòigh, sheall mion-sgrùdadh an phenotyp le bhith a’ cur an cèill comharran gnìomhachaidh (CD25 agus CD137) agus comharran crìonadh [pròtain bàis cealla prògramaichte 1 (PD1)] ged a tha feartan metabolach nan sluaghan sin eadar-dhealaichte (Figear S1, B gu E), nach deach eadar-dhealachaidhean metabolach cudromach sam bith fhaicinn gu cunbhalach eadar fo-sheataichean naive, èifeachdach no cuimhne (Figear S1, F gu I). Chaidh na toraidhean seo a dhearbhadh le bhith a’ cleachdadh dhòighean ionnsachaidh innealan gus phenotyps cealla a shònrachadh gu fèin-ghluasadach (21), a nochd tuilleadh làthaireachd àireamh mhòr de cheallan smior cnàimh (CD45 + / CD3- / CD4 + / CD45RO +) ann an ascites an euslaintich (Figear S2A). Am measg nan seòrsaichean cealla uile a chaidh a chomharrachadh, sheall an sluagh cealla myeloid seo an ìre as àirde de ghabhail a-steach glùcois agus gnìomhachd mitochondrial (Figear S2, B gu G). Tha na toraidhean seo a’ soilleireachadh nan eadar-dhealachaidhean metabolach làidir eadar na diofar sheòrsaichean cealla a lorgar ann an ascites agus tumhair ann an euslaintich HGSC.
Is e am prìomh dhùbhlan ann a bhith a’ tuigsinn feartan metabonomic TIL an fheum air sampallan cealla T de ghlanachd, càileachd agus meud gu leòr a sgaradh bho tumhair. Tha sgrùdaidhean o chionn ghoirid air sealltainn gum faod dòighean seòrsachaidh agus beairteachaidh grìogagan stèidhichte air cytometry sruthadh leantainn gu atharrachaidhean ann am pròifilean metabolite ceallach (22-24). Gus faighinn thairis air an duilgheadas seo, rinn sinn an dòigh beairteachaidh grìogagan nas fheàrr gus TIL a sgaradh agus a sgaradh bho aillse ubhagach daonna a chaidh a thoirt air falbh gu lannsaireachd mus deach a sgrùdadh le LC-MS / MS (faic Stuthan agus Modhan; Figear 2A). Gus measadh a dhèanamh air buaidh iomlan a’ phròtacal seo air atharrachaidhean metabolite, rinn sinn coimeas eadar pròifilean metabolite cheallan T a chaidh a ghnìomhachadh le luchd-tabhartais fallain às deidh a’ cheum dealachaidh grìogagan gu h-àrd le ceallan nach deach an sgaradh le grìogagan ach a dh’ fhan air deigh. Lorg an sgrùdadh smachd càileachd seo gu bheil co-dhàimh àrd eadar an dà chumha seo (r = 0.77), agus tha ath-aithris teicnigeach a’ bhuidheann de 86 metabolites àrd (Figear 2B). Mar sin, faodaidh na modhan sin mion-sgrùdadh ceart air metabolites a dhèanamh ann an ceallan a tha a’ faighinn beairteachadh seòrsa cealla, agus mar sin a’ toirt seachad a’ chiad àrd-ùrlar àrd-rèiteachaidh airson metabolites sònraichte a chomharrachadh ann an HGSC, agus mar sin a’ toirt cothrom do dhaoine tuigse nas doimhne fhaighinn air sònrachas cealla prògram metabolism feise.
(A) Diagram sgemataigeach de bheairteachadh le grìogagan magnetach. Mus tèid an sgrùdadh le LC-MS/MS, thèid na ceallan tro thrì cuairtean leantainneach de bheairteachadh le grìogagan magnetach no fuirichidh iad air deigh. (B) Buaidh an t-seòrsa beairteachaidh air pailteas nam metabolites. Cuibheasachd trì tomhasan airson gach seòrsa beairteachaidh ± SE. Tha an loidhne liath a’ riochdachadh dàimh 1:1. An co-dhàimh intra-chlas (ICC) de thomhasan ath-aithrisichte air a shealltainn anns an leubail axis. NAD, nicotinamide adenine dinucleotide. (C) Diagram sgemataigeach de shruth-obrach mion-sgrùdadh metabolite euslaintich. Tha ascites no tumhair air an cruinneachadh bho euslaintich agus air an crio-ghleidheadh. Chaidh pàirt bheag de gach sampall a sgrùdadh le cytometry sruthadh, agus chaidh na sampallan a bha air fhàgail tro thrì cuairtean de bheairteachadh airson ceallan CD4+, CD8+ agus CD45-. Chaidh na bloighean cealla seo a sgrùdadh a’ cleachdadh LC-MS/MS. (D) Mapa teas de pailteas metabolite àbhaisteach. Tha an dendrogram a’ riochdachadh cruinneachadh Ward de astaran Euclidean eadar sampallan. (E) Mion-sgrùdadh prìomh phàirtean (PCA) de mhapa metabolite an t-sampall, a’ sealltainn trì leth-bhreacan de gach sampall, tha sampallan bhon aon euslainteach ceangailte ri chèile le loidhne. (F) PCA pròifil metabolite an t-sampall air a chumhachadh air an euslainteach (ie, a’ cleachdadh ath-riochdachadh pàirteach); tha an seòrsa sampall air a chuingealachadh leis a’ chnap cobharach. PC1, prìomh phàirt 1; PC2, prìomh phàirt 2.
An ath rud, chuir sinn an dòigh-obrach beairteachaidh seo an sàs gus 99 metabolites a sgrùdadh anns na bloighean cealla CD4 +, CD8 + agus CD45 anns na prìomh ascites agus tumhair sia euslaintich HGSC (Figear 2C, Figear S3A agus Clàr S3 agus S4). Tha an sluagh inntinneach a’ dèanamh suas 2% gu 70% den t-sampall mòr tùsail de cheallan beò, agus tha co-roinn nan ceallan ag atharrachadh gu mòr eadar euslaintich. Às deidh na grìogagan a sgaradh, tha an bloigh bheairteachaidh inntinneach (CD4 +, CD8 + no CD45-) a’ dèanamh suas còrr air 85% de na ceallan beò gu lèir san sampall gu cuibheasach. Leigidh an dòigh-obrach beairteachaidh seo leinn sluaghan cealla a sgrùdadh bho metabolism clò tumhair daonna, rud nach gabh a dhèanamh bho shampaill mhòra. A’ cleachdadh a’ phròtacal seo, cho-dhùin sinn gu robh l-kynurenine agus adenosine, an dà metabolite dìonachd-bhacadh seo a bha air an deagh chomharrachadh, air an àrdachadh ann an ceallan T tumhair no ceallan tumhair (Figear S3, B agus C). Mar sin, tha na toraidhean seo a’ sealltainn dìlseachd agus comas ar teicneòlas dealachaidh cealla agus speactramachd mais gus metabolites cudromach a thaobh bith-eòlas a lorg ann am figheagan euslaintich.
Nochd an anailis againn cuideachd sgaradh metabolach làidir de sheòrsan cealla taobh a-staigh agus eadar euslaintich (Figear 2D agus Figear S4A). Gu sònraichte, an taca ri euslaintich eile, sheall euslainteach 70 feartan metabolach eadar-dhealaichte (Figear 2E agus Figear S4B), a’ nochdadh gum faodadh neo-chunbhalachd metabolach mòr a bhith eadar euslaintich. Is fhiach a thoirt fa-near, an taca ri euslaintich eile (1.2 gu 2 liotair; Clàr S1), gu robh an ìre iomlan de ascites a chaidh a chruinneachadh ann an euslainteach 70 (80 ml) nas lugha. Tha smachd air neo-chunbhalachd eadar euslaintich rè mion-sgrùdadh prìomh phàirtean (mar eisimpleir, a’ cleachdadh mion-sgrùdadh iomadachd pàirteach) a’ sealltainn atharrachaidhean cunbhalach eadar seòrsan cealla, agus tha na seòrsan cealla agus/no meanbh-àrainneachd air an cruinneachadh gu soilleir a rèir pròifil a’ mheatabolait (Figear 2F). Chuir mion-sgrùdadh air meatabolaitean singilte cuideam air na buaidhean sin agus nochd e eadar-dhealachaidhean mòra eadar seòrsan cealla agus meanbh-àrainneachd. Is fhiach a thoirt fa-near gur e MNA an diofar as miosa a chaidh fhaicinn, a tha mar as trice air a bheairteachadh ann an ceallan CD45- agus ann an ceallan CD4+ agus CD8+ a bhios a’ dol a-steach don tumhair (Figear 3A). Airson ceallan CD4+, tha a’ bhuaidh seo as follaisiche, agus tha coltas gu bheil buaidh mhòr aig an àrainneachd air an MNA ann an ceallan CD8+ cuideachd. Ach chan eil seo cudromach, leis nach urrainnear ach triùir de na sia euslaintich a mheasadh airson sgòran CD8+ tumhair. A bharrachd air MNA, ann an diofar sheòrsaichean cheallan ann an ascites agus tumhair, tha metabolites eile aig a bheil droch chomharran ann an TIL cuideachd beairteach ann an diofar dhòighean (Figearan S3 agus S4). Mar sin, tha an dàta seo a’ nochdadh seata gealltanach de metabolites immunomodulatory airson tuilleadh rannsachaidh.
(A) Susbaint àbhaisteach de MNA ann an ceallan CD4+, CD8+ agus CD45- bho ascites agus tumhair. Tha am bogsa-plota a’ sealltainn a’ mheadhain (loidhne), an raon eadar-chairtealach (lùdag frèam) agus an raon dàta, suas ri 1.5 uiread an raon eadar-chairtealach (feusag frèam). Mar a chaidh a mhìneachadh ann an Stuthan is Modhan Euslaintich, cleachd luach limma an euslaintich gus an luach P a dhearbhadh (*P<0.05 agus **P<0.01). (B) Diagram sgemataigeach de metabolism MNA (60). Meataibileidean: S-adenosyl-1-methionine; SAH, S-adenosine-1-homocysteine; NA, nicotinamide; MNA, 1-methylnicotinamide; 2-PY, 1-methyl-2-pyridone-5-carboxamide; 4-PY, 1-methyl-4-pyridone-5-carboxamide; NR, nicotinamide ribose; NMN, nicotinamide mononucleotide. Ensaimean (uaine): NNMT, nicotinamide N-methyltransferase; SIRT, sirtuins; NAMPT, nicotinamide phosphoribosyl transferase; AOX1, aldehyde oxidase 1; NRK, nicotinamide riboside kinase; NMNAT, nicotinamide mono Nucleotide adenylate transferase; Pnp1, purine nucleoside phosphorylase. (C) t-SNE de scRNA-seq de ascites (liath) agus tumhair (dearg; n = 3 euslaintich). (D) Abairteachadh NNMT ann an diofar shluagh cealla air an comharrachadh a’ cleachdadh scRNA-seq. (E) Abairteachadh NNMT agus AOX1 ann an SK-OV-3, ceallan dubhaig daonna embryonach (HEK) 293T, ceallan T agus ceallan T air an làimhseachadh le MNA. Tha an abairt fillte air a shealltainn an coimeas ri SK-OV-3. Tha am pàtran abairt le SEM air a shealltainn (n = 6 luchd-tabhartais fallain). Thathas den bheachd nach gabh luachan Ct nas motha na 35 a lorg (UD). (F) Abairteachadh SLC22A1 agus SLC22A2 ann an ceallan-T SK-OV-3, HEK293T agus ceallan-T air an làimhseachadh le 8mM MNA. Tha am pàtran abairteachaidh fillte air a shealltainn an coimeas ri SK-OV-3. Tha am pàtran abairteachaidh le SEM air a shealltainn (n = 6 luchd-tabhartais fallain). Thathas den bheachd nach gabh luachan Ct nas motha na 35 a lorg (UD). (G) Susbaint cealla MNA ann an ceallan-T luchd-tabhartais fallain gnìomhaichte an dèidh 72 uair a thìde de ghoir le MNA. Tha am pàtran abairteachaidh le SEM air a shealltainn (n = 4 luchd-tabhartais fallain).
Tha MNA air a thoirt gu buil le bhith a’ gluasad a’ bhuidheann methyl bho S-adenosyl-1-methionine (SAM) gu nicotinamide (NA) le nicotinamide N-methyltransferase (NNMT; Figear 3B). Tha cus NNMT air a chur an cèill ann an grunn aillsean daonna agus tha e co-cheangailte ri iomadachadh, ionnsaigh agus metastasis (25-27). Gus tuigse nas fheàrr fhaighinn air tùs MNA ann an ceallan-T ann an TME, chleachd sinn scRNA-seq gus caractar a thoirt air mar a tha NNMT air a chur an cèill thar sheòrsachan cealla ann an ascites agus tumhair trì euslaintich HGSC (Clàr S5). Sheall mion-sgrùdadh air timcheall air 6,500 cealla, ann an àrainneachdan ascites agus tumhair, gu robh cur an cèill NNMT air a chuingealachadh ris na sluaghan cealla fibroblast agus tumhair a thathar a’ meas (Figear 3, C agus D). Is fhiach a thoirt fa-near nach eil cur an cèill NNMT follaiseach ann an sluagh sam bith a tha a’ cur an cèill PTPRC (CD45 +) (Figear 3D agus Figear S5A), a tha a’ nochdadh gu bheil an MNA a chaidh a lorg anns an speactram metabolite air a thoirt a-steach do cheallan-T. Bidh abairteachadh aldehyde oxidase 1 (AOX1) ag atharrachadh MNA gu 1-methyl-2-pyridone-5-carboxamide (2-PYR) no 1-methyl-4-pyridone-5-carboxamide (4-PYR); tha Figear 3B) cuideachd cuingealaichte ris an t-sluagh de fibroblasts a tha a’ cur an cèill COL1A1 (Figear S5A), a tha còmhla a’ nochdadh nach eil comas aig ceallan T air metabolism MNA àbhaisteach. Chaidh pàtran abairteachaidh nan ginean co-cheangailte ri MNA seo a dhearbhadh le bhith a’ cleachdadh dàrna seata dàta cealla neo-eisimeileach bho ascites bho euslaintich HGSC (Figear S5B; n = 6) (16). A bharrachd air an sin, sheall mion-sgrùdadh ath-bhualadh slabhraidh polymerase cainneachdail (qPCR) de cheallan T tabhartaiche fallain air an làimhseachadh le MNA, an taca ri ceallan tumhair ovarian SK-OV-3 smachd, nach robh NNMT no AOX1 cha mhòr air a chur an cèill (Figear 3E). Tha na toraidhean ris nach robh dùil seo a’ nochdadh gum faodadh MNA a bhith air a leigeil ma sgaoil bho fibroblasts no tumhair a-steach do cheallan T faisg air làimh ann an TME.
Ged a tha na tagraichean a’ toirt a-steach teaghlach nan luchd-giùlain cation organach 1 gu 3 (OCT1, OCT2 agus OCT3) air an còdachadh leis an teaghlach giùlain soluble 22 (SLC22) (SLC22A1, SLC22A2 agus SLC22A3), chan eil na luchd-giùlain a dh’fhaodadh a bhith aig MNA fhathast air am mìneachadh (28). Sheall QPCR de mRNA bho cheallan T tabhartaiche fallain ìrean ìosal de SLC22A1 ach ìrean do-lorg de SLC22A2, a dhearbh gun deach aithris roimhe seo anns an litreachas (Figear 3F) (29). An coimeas ri sin, bha ìrean àrda den dà luchd-giùlain an cèill ann an loidhne cealla tumhair ovarian SK-OV-3 (Figear 3F).
Gus deuchainn a dhèanamh air comas ceallan-T MNA cèin a ghabhail a-steach, chaidh ceallan-T fallain bho luchd-tabhartais a chur ann an àiteach airson 72 uair a thìde ann an làthaireachd diofar dùmhlachdan de MNA. Mura h-eil MNA exogenous ann, chan urrainnear susbaint ceallach MNA a lorg (Figear 3G). Ach, sheall ceallan-T gnìomhaichte a chaidh a làimhseachadh le MNA exogenous àrdachadh ann an susbaint MNA anns na ceallan, suas ri 6 mM MNA (Figear 3G). Tha an toradh seo a’ nochdadh, a dh’ aindeoin an ìre ìosal de ghnìomhachd giùlain agus dìth a’ phrìomh enzyme a tha an urra ri metabolism MNA intracellular, gum faod TIL fhathast MNA a ghabhail a-steach.
Tha speactram nam metabolites ann an ceallan-T euslaintich agus deuchainnean in vitro air gabhail a-steach MNA a’ meudachadh a’ chothruim gum bi fibroblasts co-cheangailte ri aillse (CAF) a’ leigeil a-mach MNA agus gum faodadh ceallan tumhair feallsanachd agus gnìomh TIL a riaghladh. Gus buaidh MNA air ceallan-T a dhearbhadh, chaidh ceallan-T fallain a ghnìomhachadh in vitro an làthair no às aonais MNA, agus chaidh an iomadachadh agus an cinneasachadh cytokine aca a mheasadh. Às deidh 7 latha de bhith a’ cur MNA ris aig an dòs as àirde, chaidh an àireamh dùblachaidh sluaigh a lùghdachadh gu meadhanach, agus chaidh spionnadh a chumail suas aig a h-uile dòs (Figear 4A). A bharrachd air an sin, dh’ adhbhraich làimhseachadh MNA exogenous àrdachadh ann an co-roinn cheallan-T CD4 + agus CD8 + a’ cur an cèill factar necrosis tumhair-α (TNFα; Figear 4B). An coimeas ri sin, chaidh cinneasachadh intracellular IFN-γ a lùghdachadh gu mòr ann an ceallan-T CD4 +, ach chan ann an ceallan-T CD8 +, agus cha robh atharrachadh mòr ann an interleukin 2 (IL-2; Figear 4, C agus D). Mar sin, sheall deuchainn immunosorbent ceangailte ri enzyme (ELISA) de supernatants bho na cultaran cealla T seo air an làimhseachadh le MNA àrdachadh mòr ann an TNFα, lùghdachadh ann an IFN-γ, agus gun atharrachadh sam bith ann an IL-2 (Figear 4, E gu G). . Tha an lùghdachadh ann an IFN-γ a’ nochdadh gum faodadh pàirt a bhith aig MNA ann a bhith a’ cur bacadh air gnìomhachd an-aghaidh tumhair cheallan T. Gus buaidh MNA air citotoxicity meadhanaichte le ceallan T ath-riochdachadh, tha ceallan gabhadair antigen chimeric T (FRα-CAR-T) a tha ag amas air gabhadair folate α agus ceallan CAR-T (GFP) air an riaghladh le ceallan pròtain fluorescent uaine (GFP) -CAR-T) air an dèanamh le ceallan mononuclear fala iomaill tabhartaiche fallain (PBMC). Chaidh ceallan CAR-T a chultarachadh airson 24 uair a thìde ann an làthair MNA, agus an uairsin air an co-chultarachadh le ceallan tumhair ovarian SK-OV-3 daonna a’ cur an cèill gabhadair folate α aig co-mheas èifeachdach gu targaid de 10:1. Mar thoradh air làimhseachadh MNA, chaidh gnìomhachd marbhaidh cheallan FRα-CAR-T a lùghdachadh gu mòr, a bha coltach ri ceallan FRα-CAR-T air an làimhseachadh le adenosine (Figear 4H).
(A) Àireamh iomlan cheallan beòthail agus dùblachadh sluaigh (PD) dìreach bhon chultar air latha 7. Tha a’ ghraf bàr a’ riochdachadh a’ chuibheasachd + SEM de shia luchd-tabhartais fallain. A’ riochdachadh dàta bho co-dhiù n = 3 deuchainnean neo-eisimeileach. (B gu D) Chaidh CD3/CD28 agus IL-2 a chleachdadh gus ceallan-T a ghnìomhachadh aig na dùmhlachdan MNA fa leth aca airson 7 latha. Mus deach an anailis a dhèanamh, chaidh ceallan a bhrosnachadh le PMA/ionomycin le GolgiStop airson 4 uairean a thìde. Abairt TNFα (B) ann an ceallan-T. Eisimpleir de dhealbhan (clì) agus dàta clàr (deas) de abairt TNFα ann an ceallan beò. Abairt IFN-γ (C) agus IL-2 (D) ann an ceallan-T. Chaidh abairt cytokine a thomhas le cytometry sruthadh. Tha a’ ghraf bàr a’ riochdachadh a’ chuibheasachd (n = 6 luchd-tabhartais fallain) + SEM. Cleachd mion-sgrùdadh aon-shligheach air caochlaideachd agus tomhasan ath-aithris (*P<0.05 agus **P<0.01) gus luach P a dhearbhadh. A’ riochdachadh dàta bho co-dhiù n = 3 deuchainnean neo-eisimeileach. (E gu G) Chaidh CD3/CD28 agus IL-2 a chleachdadh gus ceallan-T a ghnìomhachadh aig na dùmhlachdan MNA fa leth aca airson 7 latha. Chaidh am meadhan a chruinneachadh ro agus às dèidh 4 uairean de bhrosnachadh PMA/ionomycin. Chaidh dùmhlachdan TNFα (E), IFN-γ (F) agus IL-2 (G) a thomhas le ELISA. Tha a’ ghraf bàr a’ riochdachadh a’ chuibheasachd (n = 5 luchd-tabhartais fallain) + SEM. Luach P air a dhearbhadh a’ cleachdadh mion-sgrùdadh aon-shligheach air atharrachaidh agus tomhasan ath-aithris (*P<0.05). Tha an loidhne dhotagach a’ comharrachadh crìoch lorg an lorg. (H) Deuchainn lysis cealla. Chaidh ceallan FRα-CAR-T no GFP-CAR-T atharrachadh le adenosine (250μM) no MNA (10 mM) airson 24 uairean, no chaidh an leigeil seachad gun làimhseachadh (Ctrl). Chaidh ceudad marbhadh cheallan SK-OV-3 a thomhas. Luach P air a dhearbhadh le deuchainn t Welch (*P<0.5 agus **P<0.01).
Gus tuigse mheacanaigeach fhaighinn air riaghladh abairtean TNFα a tha an urra ri MNA, chaidh measadh a dhèanamh air na h-atharrachaidhean ann an mRNA TNFα de cheallan T air an làimhseachadh le MNA (Figear 5A). Sheall ceallan T tabhartaiche fallain air an làimhseachadh le MNA àrdachadh dà-fhillte ann an ìrean tar-sgrìobhaidh TNFα, a’ nochdadh gu bheil MNA an urra ri riaghladh tar-sgrìobhaidh TNFα. Gus sgrùdadh a dhèanamh air an dòigh-obrach riaghlaidh seo a dh’ fhaodadh a bhith ann, chaidh dà fhactar tar-sgrìobhaidh aithnichte a bhios a’ riaghladh TNFα, is iad sin factar niùclasach cealla T gnìomhaichte (NFAT) agus pròtain sònraichte 1 (Sp1), a mheasadh mar fhreagairt do cheangal MNA ris an neach-adhartachaidh TNFα proximal (30). Tha 6 làraich ceangail NFAT aithnichte agus 2 làraich ceangail Sp1 aig an neach-adhartachaidh TNFα, a’ dol thairis air a chèile aig aon làrach [-55 paidhir bonn (bp) bhon 5'cap] (30). Sheall immunoprecipitation chromatin (ChIP) nuair a chaidh a làimhseachadh le MNA, gun do dh’ èirich ceangal Sp1 ris an neach-adhartachaidh TNFα trì uiread. Mheudaich toirt a-steach NFAT cuideachd agus dh’ fhàs e nas cudromaiche (Figear 5B). Tha an dàta seo a’ nochdadh gu bheil MNA a’ riaghladh abairt TNFα tro thar-sgrìobhadh Sp1, agus gu ìre nas lugha abairt NFAT.
(A) An coimeas ri ceallan-T air an àiteachadh às aonais MNA, an t-atharrachadh fillte ann an abairt TNFα ann an ceallan-T air an làimhseachadh le MNA. Tha am pàtran abairt le SEM air a shealltainn (n = 5 luchd-tabhartais fallain). A’ riochdachadh dàta bho co-dhiù n = 3 deuchainnean neo-eisimeileach. (B) Brosnaichear TNFα de cheallan-T air an làimhseachadh le no às aonais 8 mM MNA às deidh NFAT agus Sp1 a bhith air an cur còmhla ri (Ctrl) agus brosnachadh PMA / ionomycin airson 4 uairean a thìde. Chaidh immunoglobulin G (IgG) agus H3 a chleachdadh mar smachdan àicheil agus deimhinneach airson immunoprecipitation, fa leth. Sheall tomhas ChIP gun do mheudaich ceangal Sp1 agus NFAT ris a’ bhrosnaichear TNFα ann an ceallan air an làimhseachadh le MNA grunn thursan an taca ris a’ smachd. A’ riochdachadh dàta bho co-dhiù n = 3 deuchainnean neo-eisimeileach. Luach P air a dhearbhadh le iomadh deuchainn-t (*** P <0.01). (C) An coimeas ri ascites HGSC, sheall ceallan-T (neo-cytotoxic) barrachd abairt de TNF anns an tumhair. Tha na dathan a’ riochdachadh diofar euslaintich. Chaidh na ceallan a tha air an taisbeanadh a samplachadh air thuaiream gu 300 agus chaidh an crith gus cus-tharraing a chuingealachadh (** Padj = 0.0076). (D) Modail a thathar a’ moladh de MNA airson aillse ubhagach. Tha MNA air a thoirt gu buil ann an ceallan tumhair agus fibroblasts ann an TME agus tha e air a ghabhail suas le ceallan T. Bidh MNA ag àrdachadh ceangal Sp1 ris an neach-adhartachaidh TNFα, ag adhbhrachadh barrachd tar-sgrìobhaidh TNFα agus cinneasachadh cytokine TNFα. Bidh MNA cuideachd ag adhbhrachadh lùghdachadh ann an IFN-γ. Bidh casg air gnìomhachd cealla T ag adhbhrachadh comas marbhadh nas lugha agus fàs tumhair nas luaithe.
A rèir aithisgean, tha buaidhean an-aghaidh tumhair agus an-aghaidh tumhair aig TNFα a tha an urra ri aghaidh is cùl, ach tha dreuchd aithnichte aige ann a bhith a’ brosnachadh fàs agus metastasis aillse ubhagach (31-33). A rèir aithisgean, tha dùmhlachd TNFα ann an ascites agus clò tumhair ann an euslaintich le aillse ubhagach nas àirde na ann an clò neo-àbhaisteach (34-36). A thaobh meacanaig, faodaidh TNFα gnìomhachd, gnìomh agus iomadachadh cheallan fala geala a riaghladh, agus phenotype ceallan aillse atharrachadh (37, 38). A rèir nan co-dhùnaidhean sin, sheall mion-sgrùdadh eadar-dhealaichte air abairt gine gu robh TNF air a mheudachadh gu mòr ann an ceallan T ann an clò tumhair an taca ri ascites (Figear 5C). Cha robh an àrdachadh ann an abairt TNF follaiseach ach ann an sluagh cealla T le phenotype neo-cytotoxic (Figear S5A). Mar gheàrr-chunntas, tha an dàta seo a’ toirt taic don bheachd gu bheil buaidhean dùbailte dìonachd-bhacadh agus adhartachadh tumhair aig MNA ann an HGSC.
Tha bileagan fluorescent stèidhichte air cytometry sruthadh air a thighinn gu bhith mar am prìomh dhòigh airson metabolism TIL a sgrùdadh. Tha na sgrùdaidhean seo air sealltainn, an taca ri limfichtean fala imeallach no ceallan T bho bhuill-bodhaig limfeach àrd-sgoile, gu bheil claonadh nas àirde aig TIL luchag is daonna glùcois a ghabhail a-steach (4, 39) agus call mean air mhean air gnìomh mitochondrial (19, 40). Ged a tha sinn air toraidhean coltach fhaicinn san sgrùdadh seo, is e am prìomh leasachadh coimeas a dhèanamh eadar metabolism cheallan tumhair agus TIL bhon aon stuth tumhair a chaidh a thoirt air falbh. A rèir cuid de na h-aithisgean roimhe seo, tha gabhail glùcois nas àirde aig ceallan tumhair (CD45-EpCAM +) bho ascites agus tumhair na ceallan T CD8 + agus CD4 +, a’ toirt taic don bheachd gum faodar an gabhail glùcois àrd de cheallan tumhair a choimeas ri ceallan T. Bun-bheachd farpais cealla T. TME. Ach, tha gnìomhachd mitochondrial cheallan tumhair nas àirde na gnìomhachd cheallan T CD8 +, ach tha gnìomhachd mitochondrial coltach ri gnìomhachd cheallan T CD4 +. Tha na toraidhean seo a’ neartachadh a’ chuspair a tha a’ tighinn am bàrr gu bheil metabolism oxidative cudromach airson ceallan tumhair (41, 42). Tha iad cuideachd a’ moladh gum faodadh ceallan T CD8+ a bhith nas buailtiche do mhì-ghnìomhachd oxidative na ceallan T CD4+, no gum faodadh ceallan T CD4+ stòran gualain a bharrachd air glùcois a chleachdadh gus gnìomhachd mitochondrial a chumail suas (43, 44). Bu chòir a thoirt fa-near nach fhaca sinn eadar-dhealachadh sam bith ann an glacadh glùcois no gnìomhachd mitochondrial eadar èifeachdairean T CD4+, cuimhne èifeachdair T agus ceallan cuimhne meadhanach T ann an ascites. San aon dòigh, chan eil staid eadar-dhealachaidh cheallan T CD8+ ann an tumhair dad a dhèanamh ri atharrachaidhean ann an glacadh glùcois, a’ soilleireachadh an eadar-dhealachaidh mhòir eadar ceallan T air an cultar in vitro agus TIL daonna in vivo (22). Chaidh na beachdan sin a dhearbhadh cuideachd le bhith a’ cleachdadh roinneadh sluaigh cealla fèin-ghluasadach neo-chlaon, a nochd tuilleadh gu bheil ceallan CD45+ / CD3- / CD4+ / CD45RO+ le glacadh glùcois agus gnìomhachd mitochondrial nas àirde na ceallan tumhair cumanta ach gu bheil sluagh cealla gnìomhach metabolach aca. Is dòcha gu bheil an sluagh seo a’ riochdachadh fo-shluagh a tha coltach ri ceallan casg myeloid no ceallan dendritic plasmacytoid a chaidh an comharrachadh anns an anailis scRNA-seq. Ged a chaidh aithris air an dà rud seo ann an tumhair ubhagach daonna [45], tha feum fhathast air barrachd obrach gus cunntas a thoirt air an fho-shluagh myeloid seo.
Ged a dh’ fhaodas dòighean stèidhichte air cytometry sruthadh na h-eadar-dhealachaidhean coitcheann ann am metabolism glùcois agus oxidative eadar seòrsachan cealla a shoilleireachadh, chan eil na metabolites mionaideach a bhios glùcois no stòran gualain eile a’ dèanamh airson metabolism mitochondrial ann an TME air an dearbhadh fhathast. Feumaidh glanadh sluagh nan ceallan bhon stuth a chaidh a thoirt air falbh gus làthaireachd no neo-làthaireachd metabolites a shònrachadh do fho-sheata TIL sònraichte. Mar sin, faodaidh an dòigh beairteachaidh cealla againn còmhla ri speactrametry mais lèirsinn a thoirt seachad air na metabolites a tha air an beairteachadh gu eadar-dhealaichte ann an ceallan T agus sluaghan cealla tumhair ann an sampallan euslaintich a tha a’ maidseadh. Ged a tha buannachdan aig an dòigh seo thairis air seòrsachadh cealla gnìomhaichte le fluorescence, dh’ fhaodadh buaidh a bhith aig leabharlannan metabolite sònraichte air sgàth seasmhachd nàdarrach agus / no ìre tionndaidh luath (22). A dh’ aindeoin sin, bha an dòigh againn comasach air dà metabolites dìonachd-bhacadh aithnichte a chomharrachadh, adenosine agus kynurenine, leis gu bheil iad ag atharrachadh gu mòr eadar seòrsachan sampall.
Tha an sgrùdadh metabonomic againn air tumhair agus fo-sheòrsan TIL a’ toirt barrachd lèirsinn air àite metabolites ann an TME ovarian. An toiseach, a’ cleachdadh cytometry sruthadh, cho-dhùin sinn nach robh eadar-dhealachadh sam bith ann an gnìomhachd mitochondrial eadar tumhair agus ceallan T CD4 +. Ach, nochd sgrùdadh LC-MS / MS atharrachaidhean mòra ann am pailteas metabolites am measg nan sluaghan sin, a’ nochdadh gu bheil feum air mìneachadh faiceallach air co-dhùnaidhean mu metabolism TIL agus a ghnìomhachd metabolic iomlan. San dàrna àite, is e MNA am metabolite leis an eadar-dhealachadh as motha eadar ceallan CD45 agus ceallan T ann an ascites, chan e tumhair. Mar sin, is dòcha gu bheil buaidhean eadar-dhealaichte aig roinneadh agus àite tumhair air metabolism TIL, a tha a’ soilleireachadh an neo-chunbhalachd a dh’ fhaodadh a bhith ann am meanbh-àrainneachd sònraichte. San treas àite, tha abairt an einnsein a bhios a’ dèanamh MNA NNMT air a chuingealachadh sa mhòr-chuid ri CAF, is e sin ceallan tumhair gu ìre nas lugha, ach chithear ìrean MNA a ghabhas lorg ann an ceallan T a thig bho tumhair. Tha buaidh aithnichte aig cus abairt NNMT ann an CAF ovarian a bhios a’ brosnachadh aillse, gu ìre air sgàth adhartachadh metabolism CAF, ionnsaigh tumhair agus metastasis (27). Ged a tha an ìre iomlan de TIL meadhanach, tha an ìre de NNMT ann an CAF ceangailte gu dlùth ri fo-sheòrsa mesenchymal Atlas Genome Cancer (TCGA), a tha co-cheangailte ri droch ro-innse (27, 46, 47). Mu dheireadh, tha an ìre de dh’einnsein AOX1 a tha an urra ri lobhadh MNA cuingealaichte ri sluagh CAF cuideachd, a tha a’ nochdadh nach eil comas aig ceallan T MNA a mheatabolachadh. Tha na toraidhean seo a’ toirt taic don bheachd, ged a tha feum air tuilleadh obrach gus an lorg seo a dhearbhadh, gum faodadh ìrean àrda de MNA ann an ceallan T a bhith a’ nochdadh gu bheil meanbh-àrainneachd CAF a tha a’ cur bacadh air an t-siostam dìon ann.
Leis an ìre ìosal de ghiùlanairean MNA agus na h-ìrean do-lorg de phròtainean cudromach a tha an sàs ann am metabolism MNA, chan eil dùil ri làthaireachd MNA ann an ceallan-T. Cha b’ urrainnear NNMT no AOX1 a lorg le mion-sgrùdadh scRNA-seq agus qPCR cuimsichte de dhà chohort neo-eisimeileach. Tha na toraidhean seo a’ nochdadh nach eil MNA air a cho-chur le ceallan-T, ach air a ghabhail a-steach bho TME mun cuairt. Tha deuchainnean in vitro a’ sealltainn gu bheil ceallan-T buailteach MNA exogenous a chruinneachadh.
Tha na sgrùdaidhean in vitro againn air sealltainn gu bheil MNA exogenous ag adhbhrachadh abairt TNFα ann an ceallan-T agus a’ neartachadh ceangal Sp1 ris an neach-adhartachaidh TNFα. Ged a tha gnìomhan an-aghaidh tumhair agus an-aghaidh tumhair aig TNFα, ann an aillse ubhagach, faodaidh TNFα fàs aillse ubhagach a bhrosnachadh (31-33). Faodaidh neodrachadh TNFα ann an cultar cealla tumhair ubhagach no cuir às do chomharra TNFα ann am modalan luchaige cinneasachadh cytokine sèididh le meadhan TNFα a leasachadh agus fàs tumhair a chasg (32, 35). Mar sin, sa chùis seo, faodaidh MNA a thig bho TME a bhith na metabolite pro-sèididh tro mheacanism an urra ri TNFα tron ​​lùb autocrine, agus mar sin a’ brosnachadh tachairt agus sgaoileadh aillse ubhagach (31). Stèidhichte air a’ chomas seo, thathas a’ sgrùdadh bacadh TNFα mar àidseant leigheasach a dh’fhaodadh a bhith ann airson aillse ubhagach (37, 48, 49). A bharrachd air an sin, bidh MNA a’ cur bacadh air citotoxicity cheallan CAR-T gu ceallan tumhair ubhagach, a’ toirt seachad tuilleadh fianais airson casg dìonachd le meadhan MNA. Còmhla, tha na toraidhean seo a’ moladh modail anns a bheil tumhair agus ceallan CAF a’ leigeil a-mach MNA a-steach do TME taobh a-muigh cealla. Tro (i) brosnachadh fàs aillse ubhagach air adhbhrachadh le TNF agus (ii) casg air gnìomhachd citotocsain cealla T air adhbhrachadh le MNA, dh’ fhaodadh seo buaidh dhùbailte a bhith aige air tumhair (Figear 5D).
Mar cho-dhùnadh, le bhith a’ cur an sàs measgachadh de bheairteachadh luath cheallan, sreathanachadh aon-cheallan agus pròifileadh metabolach, nochd an sgrùdadh seo na h-eadar-dhealachaidhean mòra immunometabolomic eadar tumhair agus ceallan ascites ann an euslaintich HGSC. Sheall an anailis choileanta seo gu bheil eadar-dhealachaidhean ann an glacadh glùcois agus gnìomhachd mitochondrial eadar ceallan-T, agus chomharraich e MNA mar metabolite riaghlaidh dìonachd neo-eisimeileach neo-cheallach. Tha buaidh aig an dàta seo air mar a bheir TME buaidh air metabolism ceallan-T ann an aillsean daonna. Ged a chaidh aithris air a’ cho-fharpais dhìreach airson beathachadh eadar ceallan-T agus ceallan aillse, faodaidh metabolites cuideachd a bhith nan riaghladairean neo-dhìreach gus adhartas tumhair adhartachadh agus is dòcha freagairtean dìonachd endogenous a chumail fodha. Dh’ fhaodadh gum fosgail an tuairisgeul a bharrachd air dreuchd gnìomh nan metabolites riaghlaidh seo ro-innleachdan eile airson freagairt dìonachd an-aghaidh tumhair a neartachadh.
Fhuaireadh sampallan euslaintich agus dàta clionaigeach tron ​​stòras clò tumhair aillse BC a tha barrantaichte leis an Chanada Tissue Repository Network. A rèir a’ phròtacal a chaidh aontachadh le Comataidh Beusachd Rannsachaidh Ailse BC agus Oilthigh British Columbia (H07-00463), fhuair a h-uile sampall agus dàta clionaigeach euslaintich cead sgrìobhte fiosraichte no leig iad seachad an cead gu foirmeil. Tha na sampallan air an stòradh anns a’ BioBank barrantaichte (BRC-00290). Tha feartan mionaideach euslaintich air an sealltainn ann an Clàran S1 agus S5. Airson crio-ghlèidheadh, thathas a’ cleachdadh scalpel gus sampall tumhair an euslaintich a lobhadh gu meacanaigeach agus an uairsin a phutadh tro chriathrag 100-micron gus crochadh cealla singilte fhaighinn. Chaidh ascites an euslaintich a chuir ann an ceud-fhulangas aig 1500 rpm airson 10 mionaidean aig 4°C gus na ceallan a pheileagadh agus an t-supernatant a thoirt air falbh. Chaidh ceallan a fhuaireadh bho tumhair agus ascites a chrio-ghlèidheadh ​​ann an 50% serum AB daonna neo-ghnìomhach le teas (Sigma-Aldrich), 40% RPMI-1640 (Thermo Fisher Scientific) agus 10% dimethyl sulfoxide. Chaidh na crochaidhean cealla singilte gleidhte seo a leaghadh agus an cleachdadh airson dearbhadh metabolomics agus metabolite mar a tha air a mhìneachadh gu h-ìosal.
Tha am meadhan slàn air a dhèanamh suas de 0.22 μm air a shìoladh 50:50 le cur-ris de RPMI 1640: AimV. RPMI 1640 + 2.05 mM l-glutamine (Thermo Fisher Scientific) le 10% serum daonna AB neo-ghnìomhach le teas (Sigma-Aldrich) air a chur ris, 12.5 mM Hepes (Thermo Fisher Scientific), 2 mM l-glutamine (Thermo Fisher Scientific) Fisher Scientific), 1 x fuasgladh Penicillin Streptomycin (PenStrep) (Thermo Fisher Scientific) agus 50 μMB-mercaptoethanol. Tha 20 mM Hepes (Thermo Fisher Scientific) agus 2 mM l-glutamine (Thermo Fisher Scientific) air a chur ri AimV (Invitrogen). Bha am bufair dathaidh cytometer sruthadh air a dhèanamh suas de 0.22μm saline bufair fosfáit air a shìoladh (PBS; Invitrogen) le 3% serum daonna AB neo-ghnìomhach le teas (Sigma) air a chur ris. Tha am bufair beairteachaidh cealla air a dhèanamh suas de PBS sìolaichte 0.22μm agus air a chur ri 0.5% serum daonna AB neo-ghnìomhach le teas (Sigma-Aldrich).
Ann am meadhan coileanta 37°C, chaidh na ceallan a dhath le 10 nM MT DR agus 100 μM 2-NBDG airson 30 mionaid. An uairsin, chaidh na ceallan a dhath le dath beòshlaint eF506 aig 4°C airson 15 mionaid. Ath-chroch na ceallan ann am FC Block (eBioscience) agus Brilliant Stain Buffer (BD Biosciences), caolaich iad ann am bufair dathaidh cytometry sruthadh (a rèir stiùiridhean an neach-dèanamh), agus goir iad airson 10 mionaidean aig teòthachd an t-seòmair. Dath na ceallan le seata de antibodies (Clàr S2) ann am bufair dathaidh cytometry sruthadh aig 4°C airson 20 mionaid. Ath-chroch na ceallan ann am bufair dathaidh cytometry sruthadh (Cytek Aurora; rèiteachadh 3L-16V-14B-8R) mus tèid an sgrùdadh. Cleachd SpectroFlo agus FlowJo V10 gus dàta cunntadh cealla a sgrùdadh, agus cleachd GraphPad Prism 8 gus an dàta a chruthachadh. Chaidh dian meadhanach an fhlùraiseachd (MFI) de 2-NBDG agus MT DR a dhèanamh àbhaisteach a rèir log, agus an uairsin chaidh deuchainn t càraideach a chleachdadh airson mion-sgrùdadh staitistigeil gus cunntas a thoirt air euslaintich a bha co-ionnan. Thoir air falbh a h-uile sluagh le nas lugha na 40 tachartas bhon mhion-sgrùdadh; cuir a-steach luach MFI de 1 airson luachan àicheil sam bith mus dèan thu mion-sgrùdadh staitistigeil agus lèirsinn dàta.
Gus cur ris an ro-innleachd geataidh làimhe den phannal pròiseis gu h-àrd, chleachd sinn an làn-anotachadh leis a’ chraobh cuingealachaidh chumaidhean (FAUST) (21) gus ceallan a shònrachadh gu fèin-ghluasadach don t-sluagh às deidh ceallan marbha a thoirt air falbh ann am FlowJo. Bidh sinn a’ riaghladh an toraidh le làimh gus sluaghan a tha coltach gu bheil iad air an riarachadh gu ceàrr (a’ cothlamadh ceallan PD1+ le ceallan tumhair PD1) agus sluaghan a tha air an cumail a chur còmhla. Tha cuibheasachd de chòrr air 2% de cheallan anns gach sampall, airson 11 sluagh gu h-iomlan.
Chaidh ceudrifugachadh dùmhlachd caisead Ficoll a chleachdadh gus PBMC a sgaradh bho thoraidhean dealachaidh leukocyte (STEMCELL Technologies). Chaidh ceallan T CD8 + a sgaradh bho PBMC a’ cleachdadh CD8 MicroBeads (Miltenyi) agus chaidh an leudachadh ann am meadhan iomlan a’ cleachdadh TransAct (Miltenyi) airson 2 sheachdain a rèir stiùiridhean an neach-dèanamh. Chaidh leigeil leis na ceallan seasamh airson 5 latha ann am meadhan iomlan anns an robh IL-7 (10 ng / ml; PeproTech), agus an uairsin chaidh an ath-bhrosnachadh le TransAct. Air latha 7, a rèir stiùiridhean an neach-dèanamh, chaidh CD45 MicroBeads daonna (Miltenyi) a chleachdadh gus ceallan a neartachadh ann an trì cuairtean leantainneach. Chaidh na ceallan a roinn airson mion-sgrùdadh cytometry sruthadh (mar a chaidh a mhìneachadh gu h-àrd), agus chaidh millean cealla a roinn trì tursan airson mion-sgrùdadh LC-MS / MS. Chaidh na sampallan a phròiseasadh le LC-MS / MS mar a chaidh a mhìneachadh gu h-ìosal. Rinn sinn measadh air luach metabolite a bha a dhìth le àireamh ian de 1,000. Tha gach sampall air a cho-chothromachadh leis an àireamh iomlan ian (TIC), air a thionndadh gu logaritmach agus air a cho-chothromachadh gu fèin-ghluasadach ann am MetaboAnalystR mus tèid a sgrùdadh.
Chaidh crochadh cealla singilte gach euslaintich a leaghadh agus a shìoladh tro shìoltachan 40 μm gu meadhan iomlan (mar a chaidh a mhìneachadh gu h-àrd). A rèir protocol an neach-dèanamh, chaidh trì cuairtean leantainneach de thaghadh adhartach le dealachadh grìogagan magnetach a’ cleachdadh MicroBeads (Miltenyi) a chleachdadh gus na sampallan a neartachadh airson ceallan CD8+, CD4+ agus CD45- (air deigh). Ann an ùine ghoirid, tha na ceallan air an ath-chreachadh ann am bufair beairteachaidh cealla (mar a chaidh a mhìneachadh gu h-àrd) agus air an cunntadh. Chaidh na ceallan a ghoir le grìogagan CD8 daonna, grìogagan CD4 daonna no grìogagan CD45 daonna (Miltenyi) aig 4°C airson 15 mionaidean, agus an uairsin air an nighe le bufair beairteachaidh cealla. Tha an sampall air a chur tron ​​cholbh LS (Miltenyi), agus tha na bloighean adhartach is àicheil air an cruinneachadh. Gus an ùine a lughdachadh agus an ceum ath-bheothachaidh cealla a mheudachadh, tha am bloigh CD8 an uairsin air a chleachdadh airson an dàrna cuairt de bheairteachadh CD4+, agus tha am bloigh CD4 air a chleachdadh airson an neartachadh CD45 às deidh sin. Cùm am fuasgladh air deigh tron ​​phròiseas dealachaidh.
Gus sampallan ullachadh airson mion-sgrùdadh metabolite, chaidh na ceallan a nighe aon uair le fuasgladh salainn reòthte, agus chaidh 1 ml de 80% methanol a chur ri gach sampall, an uairsin chaidh an cur ann am vortex agus an reothadh gu sgiobalta ann an naitridean leaghaidh. Chaidh na sampallan a chur tro thrì cuairtean reothadh-leaghaidh agus chaidh an cur ann an centrifuge aig 14,000 rpm airson 15 mionaidean aig 4°C. Chaidh an t-supernatant anns a bheil na metabolites a ghalachadh gus am biodh e tioram. Chaidh na metabolites ath-leaghadh ann an 50 μl de 0.03% searbhag formach, chaidh an cur ann am vortex gus am measgachadh, agus an uairsin chaidh an cur ann an centrifuge gus sprùilleach a thoirt air falbh.
Thoir a-mach na metabolites mar a chaidh a mhìneachadh gu h-àrd. Gluais an supernatant gu botal cromatagrafaidheachd lionn àrd-choileanaidh airson rannsachadh metabolomics. Cleachd pròtacal làimhseachaidh air thuaiream gus gach sampall a làimhseachadh le àireamh choltach de cheallan gus casg a chuir air buaidhean baidse. Rinn sinn measadh càileachdail air metabolites cruinneil a chaidh fhoillseachadh roimhe air an AB SCIEX QTRAP 5500 Triple Quadrupole Mass Spectrometer (50). Chaidh mion-sgrùdadh cromatagrafach agus amalachadh farsaingeachd mullaich a dhèanamh a’ cleachdadh bathar-bog MultiQuant dreach 2.1 (Applied Biosystems SCIEX).
Chaidh cunntadh ian de 1000 a chleachdadh gus luach a’ mheatabolaid a bha a dhìth a thomhas, agus chaidh TIC gach sampall a chleachdadh gus farsaingeachd mullaich àbhaisteach gach meatabolaid a chaidh a lorg obrachadh a-mach gus ceartachadh a dhèanamh airson atharrachaidhean a chaidh a thoirt a-steach leis an anailis ionnsramaid bho phròiseasadh an t-sampall. Às deidh don TIC a bhith air a àbhaisteachadh, thathas a’ cleachdadh MetaboAnalystR(51) (paramadair bunaiteach) airson tionndadh logarithmic agus sgèileadh loidhne àbhaisteach fèin-ghluasadach. Chleachd sinn PCA le pasgan vegan R gus mion-sgrùdadh rannsachail a dhèanamh air eadar-dhealachaidhean meatabolome eadar seòrsachan sampall, agus chleachd sinn mion-sgrùdadh pàirt-iomarcachd gus euslaintich a sgrùdadh. Cleachd dòigh Ward gus dendrogram mapa teas a thogail gus an astar Euclidean eadar sampallan a chruinneachadh. Chleachd sinn limma (52) air pailteas meatabolaid àbhaisteach gus meatabolaidean eadar-dhealaichte pailt a chomharrachadh thar an t-seòrsa cealla agus meanbh-àrainneachd gu lèir. Gus an mìneachadh a dhèanamh nas sìmplidhe, bidh sinn a’ cleachdadh paramadair cuibheasach na buidhne gus am modail a shònrachadh, agus a’ beachdachadh air na seòrsachan cealla anns a’ mheanbh-àrainneachd mar gach buidheann (n = 6 buidhnean); Airson an deuchainn cudromachd, rinn sinn trì tomhasan ath-aithris airson gach metabolite. Gus casg a chur air ath-riochdachadh meallta, chaidh an t-euslainteach a ghabhail a-steach mar bhacadh ann an dealbhadh an limma. Gus sgrùdadh a dhèanamh air na h-eadar-dhealachaidhean ann am metabolites eadar diofar euslaintich, dh’atharraich sinn modail an limma a’ gabhail a-steach euslaintich ann an dòigh stèidhichte. Tha sinn ag aithris cudromachd an eadar-dhealachaidh ro-shònraichte eadar an seòrsa cealla agus meanbh-àrainneachd Padj <0.05 (ceartachadh Benjamini-Hochberg).
Às dèidh beairteachadh spionnadh le bhith a’ cleachdadh Pasgan Toirt Air Falbh Ceallan Marbh Miltenyi (>80% beòthachd), chaidh sreath-sgrùdadh transcriptome aon-chealla a dhèanamh air na sampallan ascites is tumhair reòta beò gu lèir a’ cleachdadh protocol abairt gine 10x 5′. Chaidh còig cùisean le tumhair is ascites co-ionnan a sgrùdadh, ged a chuir beòthachd ìosal bho aon sampall tumhair casg air a thoirt a-steach. Gus iomadh taghadh de dh’euslaintich a choileanadh, chuir sinn na sampallan bho gach euslainteach còmhla ann an sreathan an rianadair cròmium 10x, agus rinn sinn mion-sgrùdadh air làraichean an ascites agus an tumhair air leth. Às dèidh sreath-sgrùdadh [Illumina HiSeq 4000 28 × 98 bp ceann paidhir (PE), genome Quebec; cuibheasachd de 73,488 agus 41,378 leughaidhean gach cealla airson tumhair agus ascites fa leth]], chleachd sinn CellSNP agus Vireo (53) (stèidhichte air CellSNP mar Tha dearbh-aithne tabhartaiche air a shònrachadh don SNP daonna cumanta (VCF) a tha air a thoirt seachad le GRCh38. Bidh sinn a’ cleachdadh SNPRelate gus an dearbh-aithne as dlùithe (IBS) a dhearbhadh a thaobh inbhe genotype an euslaintich (IBS), ach a-mhàin ceallan gun shònrachadh agus ceallan air an comharrachadh mar dhùblaidhean agus tabhartaichean a tha a’ maidseadh eadar ascites agus sampallan tumhair (54). Air bunait na h-obrach seo, chùm sinn trì cùisean le riochdachadh cealla pailt anns an tumhair agus ascites airson mion-sgrùdadh sìos an abhainn. Às deidh ceum sìolaidh mòr a dhèanamh ann am pasgan BioConductor sgapte (55) agus sgrìobach (56), thug seo a-mach 6975 ceallan (2792 agus 4183 ceallan bho tumhair agus ascites, fa leth) airson mion-sgrùdadh. Bidh sinn a’ cleachdadh cruinneachadh Louvain igraph (57) de lìonra nàbaidh as fhaisge co-roinnte (SNN) stèidhichte air astar Jaccard gu ceallan cruinneachaidh a rèir abairt. An Chaidh cruinneachaidhean a chomharrachadh le làimh ri seòrsachan cealla a bha coltach ri chèile stèidhichte air abairt gine comharrachaidh agus chaidh an sealltainn gu follaiseach le t-SNE. Tha ceallan T cytotoxic air am mìneachadh le abairt CD8A agus GZMA, ach a-mhàin fo-chruinneachaidhean le abairt pròtain ribosomal ìosal. Rinn sinn cothrom air dàta foillsichte Izar et al. (16), a’ gabhail a-steach an leabachadh t-SNE aca, a dh’ fhaodas smachd a chumail air an tar-lùbadh abairt eadar comharran cealla dìonachd agus abairt NNMT.
Chaidh PBMC a sgaradh bho thoraidhean dealachaidh leukocyte (STEMCELL Technologies) le bhith a’ cleachdadh ceud-fhuadachadh dùmhlachd caisead Ficoll. Chaidh ceallan CD3+ a sgaradh bho PBMC a’ cleachdadh grìogagan CD3 (Miltenyi). Le no às aonais MNA, chaidh ceallan CD3+ a ghnìomhachadh le CD3 ceangailte ri plàta (5μg/ml), CD28 soluble (3μg/ml) agus IL-2 (300 U/ml; Proleukin). Air an latha mu dheireadh den leudachadh, chaidh am beòshlaint (Fixable Viability Dye eFluor450, eBioscience) agus iomadachadh (123count eBeads, Thermo Fisher Scientific) a mheasadh le cytometry sruthadh. Dèan measadh air gnìomh an èifeachdair le bhith a’ brosnachadh cheallan le PMA (20 ng/ml) agus ionomycin (1μg/ml) le GolgiStop airson 4 uairean a thìde, agus cùm sùil air CD8-PerCP (RPA-T8, BioLegend), CD4-AF700 (RPA-T4), BioLegend) agus TNFα-fluorescein isothiocyanate (FITC) (MAb11, BD). Brosnaich ceallan qPCR agus ChIP le PMA (20 ng/ml) agus ionomycin (1μg/ml) airson 4 uairean a thìde. Chaidh an t-supernatant ELISA a chruinneachadh ro agus às dèidh brosnachadh le PMA (20 ng/ml) agus ionomycin (1 μg/ml) airson 4 uairean a thìde.
Lean pròtacal an neach-dèanamh gus RNA a sgaradh a’ cleachdadh Pasgan RNeasy Plus Mini (QIAGEN). Cleachd QIAshredder (QIAGEN) gus an sampall a dhèanamh co-chothromach. Cleachd pasgan RNA àrd-chomasach gu cDNA (Thermo Fisher Scientific) gus DNA co-phàirteach (cDNA) a cho-chur. Cleachd TaqMan Rapid Advanced Master Mix (Thermo Fisher Scientific) gus abairt gine a thomhas (a rèir pròtacal an neach-dèanamh) leis na proban a leanas: Hs00196287_m1 (NNMT), Hs00154079_m1 (AOX1), Hs00427552_m1 (SLC22A1), Hs02786624_g1 [glyceraldehyde-3-phosphate off Hydrogen (GAPDH)] agus Hs01010726_m1 (SLC22A2). Chaidh na sampallan a ruith air siostam PCR fìor-ùine StepOnePlus (Applied Biosystems) (Applied Biosystems) ann am plàta ath-bhualadh optigeach luath 96-tobar MicroAmp (Applied Biosystems) le film optigeach MicroAmp. Thathas den bheachd gu bheil luach Ct sam bith a tha nas àirde na 35 os cionn na stairsnich lorg agus tha e air a chomharrachadh mar neo-lorgaichte.
Dèan ChIP mar a chaidh a mhìneachadh roimhe (58). Ann an ùine ghoirid, chaidh na ceallan a làimhseachadh le formaldehyde (dùmhlachd deireannach 1.42%) agus an goradh aig teòthachd an t-seòmair airson 10 mionaidean. Cleachd bufair atachaidh le taic (25 mM Hepes, 1.5 mM MgCl2, 10 mM KCl agus 0.1% NP-40) air deigh airson 10 mionaidean, an uairsin ath-fhuadaich ann am bufair immunoprecipitation mar a chaidh a mhìneachadh (58). Chaidh an sampall an uairsin a sonicachadh leis na cuairtean a leanas: 10 cuairtean (20 cuisle 1-diog) agus ùine statach de 40 diogan. Goradh antibodies immunoglobulin G ìre ChIP (Cell Signaling Technology; 1μl), histone H3 (Cell Signaling Technology; 3μl), NFAT (Invitrogen; 3μl) agus SP1 (Cell Signaling Technology; 3μl) leis an sampall aig 4°CC agus crathadh thar oidhche. Goir grìogagan pròtain A (Thermo Fisher Scientific) leis an sampall aig 4°C le crathadh socair airson 1 uair a thìde, an uairsin cleachd grìogagan chelex (Bio-Rad) gus an DNA a neartachadh, agus cleachd proteinase K (Thermo Fisher) airson cnàmhadh pròtain. Chaidh brosnaichear TNFα a lorg le PCR: air adhart, GGG TAT CCT TGA TGC TTG TGT; air an làimh eile, GTG CCA ACA ACT GCC TTT ATA TG (toradh 207-bp). Chaidh na h-ìomhaighean a thoirt gu buil le Image Lab (Bio-Rad) agus an tomhas le bhith a’ cleachdadh bathar-bog ImageJ.
Chaidh an t-supernatant cultar cealla a chruinneachadh mar a chaidh a mhìneachadh gu h-àrd. Chaidh an dearbhadh a dhèanamh a rèir modhan-obrach an neach-dèanamh airson pasgan ELISA TNFα daonna (Invitrogen), pasgan ELISA IL-2 daonna (Invitrogen) agus pasgan ELISA IFN-γ daonna (Abcam). A rèir protocol an neach-dèanamh, chaidh an t-supernatant a lagachadh 1:100 gus TNFα agus IL-2 a lorg, agus 1:3 gus IFN-γ a lorg. Cleachd EnVision 2104 Multilabel Reader (PerkinElmer) gus gabhail a-steach aig 450 nm a thomhas.
Chaidh PBMC a sgaradh bho thoraidhean dealachaidh leukocyte (STEMCELL Technologies) le bhith a’ cleachdadh meadhan-chriathradh dùmhlachd caisead Ficoll. Chaidh ceallan CD3+ a sgaradh bho PBMC a’ cleachdadh grìogagan CD3 (Miltenyi). Le no às aonais MNA, chaidh ceallan CD3+ a ghnìomhachadh le CD3 ceangailte ri truinnsear (5μg/ml), CD28 soluble (3μg/ml) agus IL-2 (300 U/ml; Proleukin) airson 3 latha. Às dèidh 3 latha, chaidh na ceallan a chruinneachadh agus a nighe le saline 0.9%, agus chaidh am peileat a reothadh gu sgiobalta. Chaidh cunntadh cheallan a dhèanamh le cytometry sruthadh (Cytek Aurora; rèiteachadh 3L-16V-14B-8R) a’ cleachdadh 123count eBeads.
Meatabolitean an earrainn mar a chaidh a mhìneachadh gu h-àrd. Chaidh an earrann thioram ath-chruthachadh aig dùmhlachd de 4000 co-ionann cealla/μl. Dèan mion-sgrùdadh air an sampall le cromatagrafaidheachd ìre-aiseig (1290 Infinity II, Agilent Technologies, Santa Clara, CA) agus colbh CORTECS T3 (2.1 × 150 mm, meud gràin 1.6-μm, meud pore 120-Å; #186008500, Waters). Speictriméadar mais pòlar (6470, Agilent), anns a bheil ianachadh electrospray ag obair ann am modh deimhinneach. Is e 0.1% searbhag formach (ann an H2O) ìre gluasadach A, is e 90% acetonitrile, 0.1% searbhag formach ìre gluasadach B. Tha an caisead LC eadar 0 agus 2 mhionaid airson 100% A, 2 agus 7.1 mionaidean airson 99% B, agus 7.1 gu 8 mionaidean airson 99% B. An uairsin ath-chothromaich an colbh le ìre gluasadach A aig ìre sruthadh de 0.6 ml/min airson 3 mionaidean. Tha an ìre sruthadh 0.4ml/min, agus tha seòmar a’ cholbh air a theasachadh gu 50°C. Cleachd inbhe cheimigeach fìor-ghlan MNA (M320995, Toronto Research Chemical Company, Ceann a Tuath Eabhrac, Ontario, Canada) gus ùine gleidhidh (RT) agus cruth-atharrachadh (RT = 0.882 mionaidean, cruth-atharrachadh 1 = 137→94.1, cruth-atharrachadh 2 = 137→92, Tionndadh 3 = 137→78) a stèidheachadh. Nuair a thachras na trì gluasadan aig an ùine gleidhidh cheart, thathar a’ cleachdadh gluasad 1 airson tomhas gus dèanamh cinnteach à sònrachas. Chaidh lùb àbhaisteach MNA (Toronto Research Chemical Company) a chruthachadh le sia caolachaidhean sreathach den fhuasgladh stoc (1 mg/ml) gus inbhean de 0.1, 1.0, 10 agus 100 ng/ml agus 1.0 agus 10μg/ml fa leth fhaighinn mar leaghan. Is e 1 ng/ml an crìoch lorg, agus tha am freagairt loidhneach eadar 10 ng/ml agus 10μg/ml. Tha gach stealladh de dhà mhicroliotair den shampall agus den inbhe air a chleachdadh airson mion-sgrùdadh LC/MS, agus tha sampall smachd càileachd measgaichte air a ruith a h-uile ochd stealladh gus dèanamh cinnteach à seasmhachd an àrd-ùrlair mion-sgrùdaidh. Bha freagairtean MNA nan sampallan cealla uile air an làimhseachadh le MNA taobh a-staigh raon loidhneach an deuchainn. Chaidh mion-sgrùdadh dàta a dhèanamh a’ cleachdadh bathar-bog mion-sgrùdaidh cainneachdail MassHunter (v9.0, Agilent).
Chaidh an dàrna ginealach de thogail αFR-CAR a thoirt bho Song et al. (59). Ann an ùine ghoirid, tha na leanas anns a’ chruinneachadh: sreath stiùiridh CD8a, criomag caochlaideach aon-slabhraidh sònraichte do αFR daonna, roinn lùdag is thar-membran CD8a, àrainn intracellular CD27 agus àrainn intracellular CD3z. Chaidh an sreath CAR iomlan a cho-chur ri chèile le GenScript, agus an uairsin a chlònadh a-steach don vectar abairt lentiviral dàrna ginealach suas an sruth bhon chaisead abairt GFP a chaidh a chleachdadh gus èifeachdas an tar-chuir a mheasadh.
Tha lentivirus air a thoirt gu buil le tar-chur cheallan HEK293T [American Type Culture Collection (ATCC); air fhàs ann am meadhan atharraichte Dulbecco aig Eagle anns a bheil 10% serum fetal bovine (FBS) agus 1% PenStrep, agus air a chleachdadh vectar CAR-GFP agus tha na plasmidean pacaidh (psPAX2 agus pMD2.G, Addgene) a’ cleachdadh lipofection amine (Sigma-Aldrich). Chaidh an supernatant anns an robh bhìoras a chruinneachadh 48 agus 72 uair an dèidh tar-chur, air a shìoladh, agus air a dhùmhlachadh le ultra-centrifugation. Stòraich an supernatant bhìorasach dùmhlaichte aig -80°C gus an tèid a thar-chur.
Tha PBMC air an sgaradh bho thoraidhean dealachaidh leukocyte tabhartaiche fallain (STEMCELL Technologies) le bhith a’ cleachdadh meadhan-chriathradh dùmhlachd caisead Ficoll. Cleachd meanbh-ghrìogagan CD8 taghaidh adhartach (Miltenyi) gus ceallan CD8+ a sgaradh bho PBMC. Brosnaich ceallan-T le TransAct (Miltenyi) agus ann am meadhan TexMACS [Miltenyi; air a chur ri 3% serum daonna neo-ghnìomhach le teas, 1% PenStrep agus IL-2 (300 U/ml)]. Ceithir uairean fichead an dèidh a’ bhrosnachaidh, chaidh ceallan-T a thar-chur le lentivirus (10 μl de shupernatant bhìoras dùmhail gach 106 cealla). 1 gu 3 latha an dèidh tar-chur air Cytek Aurora (air FSC (Forward Scatter)/SSC (Side Scatter), Singlet, GFP+), dèan measadh air abairt GFP nan ceallan gus èifeachdas tar-chuir co-dhiù 30% a nochdadh.
Chaidh ceallan CAR-T a chur ann an àiteach airson 24 uair a thìde ann an Immunocult (STEMCELL Technologies; le 1% PenStrep air a chur ris) fo na cumhaichean a leanas: gun làimhseachadh, air an làimhseachadh le 250 μM adenosine no 10 mM MNA. Às dèidh ro-làimhseachaidh, chaidh ceallan CAR-T a nighe le PBS agus an cur còmhla ri 20,000 cealla SK-OV-3 [ATCC; ann am meadhan McCoy 5A (Sigma-Aldrich) le 10% FBS agus 1% PenStrep air a chur ris aig 10: Chaidh an co-mheas èifeachdach ri targaid de 1 a mheudachadh ann an trì leth-bhreac ann am meadhan Immunocult air a chur ris. Chaidh ceallan SK-OV-3 agus ceallan SK-OV-3 air an lysis le digitalis saponin (0.5mg/ml; Sigma-Aldrich) a chleachdadh mar smachdan àicheil agus deimhinneach, fa leth. Às dèidh 24 uair a thìde de cho-àiteachadh, chaidh an t-supernatant a chruinneachadh agus chaidh an lactate dehydrogenase (LDH) a thomhas a rèir stiùiridhean an neach-dèanamh (LDH Glo Cytotoxicity Assay Kit, Promega). Chaidh an t-snàth-shruth LDH a chaolachadh 1:50 ann am bufair LDH. Chaidh ceudad a’ mharbhaidh a thomhas a’ cleachdadh na foirmle a leanas: ceudad a’ mharbhaidh = ceudad ceartachaidh / an ìre mharbhaidh as àirde x 100%, far a bheil ceudad ceartachaidh = co-chultar - ceallan T a-mhàin, agus an ìre mharbhaidh as àirde = smachd deimhinneach - smachd àicheil.
Mar a chaidh a mhìneachadh anns an teacsa no na stuthan agus na modhan, cleachd GraphPad Prism 8, Microsoft Excel no R v3.6.0 airson mion-sgrùdadh staitistigeil. Ma thèid iomadh sampall a chruinneachadh bhon aon euslainteach (leithid ascites agus tumhair), bidh sinn a’ cleachdadh deuchainn t càraideach no a’ toirt a-steach an t-euslainteach mar bhuaidh air thuaiream ann am modail loidhneach no coitcheann mar a bhios iomchaidh. Airson mion-sgrùdadh metabolomics, thèid an deuchainn cudromachd a dhèanamh ann an trì leth-bhreac.
Airson stuthan a bharrachd airson an artaigil seo, faic http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/4/eabe1174/DC1
Is e seo artaigil fosgailte a tha air a sgaoileadh fo chumhachan Ceadachas Neo-Mhalairteach Attribution Creative Commons, a leigeas le cleachdadh, sgaoileadh agus ath-riochdachadh ann am meadhan sam bith, fhad ‘s nach eil an cleachdadh deireannach airson buannachd mhalairteach agus gur e am bun-bheachd gu bheil an obair thùsail ceart. Iomradh.
Nota: Chan eil sinn ag iarraidh ort ach do sheòladh puist-d a thoirt seachad gus am bi fios aig an neach a tha thu a’ moladh don duilleag gu bheil thu airson gum faic iad am post-d agus nach e spama a th’ ann. Cha ghlac sinn seòlaidhean puist-d sam bith.
Cleachdar a’ cheist seo gus dearbhadh a bheil thu nad neach-tadhail agus gus casg a chuir air spama fèin-ghluasadach.
Marisa K. Kilgour (Marisa K. Kilgour), Sarah MacPherson (Sarah MacPherson), Lauren G. Zacharias (Lauren G. Zacharias), Abigail Eli Aris G. Watson (H. Watson), Iain Stagg (John Stagg), Brad H. Nelson (Brad H. Nelson), Ralph J. De Bellardini (Ralph J. DeBerardin. R. Jones) Hamilton (Phineas T.
Bidh MNA a’ cur ri casg dìonachd cheallan T agus tha e a’ riochdachadh targaid imdhíon-leigheis a dh’fhaodadh a bhith ann airson aillse ann an daoine.
Marisa K. Kilgour (Marisa K. Kilgour), Sarah MacPherson (Sarah MacPherson), Lauren G. Zacharias (Lauren G. Zacharias), Abigail Eli Aris G. Watson (H. Watson), Iain Stagg (John Stagg), Brad H. Nelson (Brad H. Nelson), Ralph J. De Bellardini (Ralph J. DeBerardin. R. Jones) Hamilton (Phineas T.
Bidh MNA a’ cur ri casg dìonachd cheallan T agus tha e a’ riochdachadh targaid imdhíon-leigheis a dh’fhaodadh a bhith ann airson aillse ann an daoine.
©2021 Comann Ameireagaidh airson Adhartachadh Saidheans. gach còir glèidhte. Tha AAAS na chom-pàirtiche de HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef agus COUNTER. SaidheansAdvances ISSN 2375-2548.