Tapadh leibh airson tadhal air Nature.com. Tha taic chuingealaichte aig an dreach brabhsair a tha thu a’ cleachdadh airson CSS. Airson an eòlas as fheàrr, tha sinn a’ moladh gun cleachd thu brabhsair ùraichte (no gun cuir thu dheth modh co-chòrdalachd ann an Internet Explorer). Aig an aon àm, gus dèanamh cinnteach à taic leantainneach, bidh sinn a’ taisbeanadh an làraich gun stoidhlichean agus JavaScript.
Eu-coltach ri veirteabraich, thathas den bheachd gu farsaing nach eil hormonaichean steroid gnèitheasach claon aig biastagan a tha claon do fhireannaich. Ann an Anopheles gambiae, tha e coltach gun do dh’fhàs an steroid ecdysone 20-hydroxyecdysone (20E) gus smachd a chumail air leasachadh uighean nuair a thèid an co-chur le boireannaich2 agus gus ùine teasfhulangach suirghe a bhrosnachadh nuair a thèid an gluasad gu feise le fireannaich3. Leis gu bheil leasachadh uighean agus suirghe nan feartan gintinn riatanach, dh’ fhaodadh tuigse fhaighinn air mar a bhios mosgìotothan boireann Anopheles a’ toirt a-steach na comharran hormona sin dealbhadh phrògraman smachd malaria ùra a dhèanamh nas fhasa. An seo, tha sinn a’ nochdadh gu bheil na gnìomhan gintinn seo air an riaghladh le steroids gnèitheasach eadar-dhealaichte tro lìonra iom-fhillte de einnseanan a bhios a’ gnìomhachadh/a’ neo-ghnìomhachadh ecdysteroid. Chomharraich sinn ecdysone oxidichte sònraichte do fhireannaich, 3-dehydro-20E (3D20E), a dhìonas pàrantachd le bhith a’ dùnadh sìos gabhaltachd feise boireann às deidh gluasad feise agus gnìomhachadh le dephosphorylation. Gu sònraichte, bhrosnaich gluasad 3D20E cuideachd abairt ginean gintinn a chumas leasachadh uighean rè galar Plasmodium, a’ dèanamh cinnteach à slàinte boireannaich air a bheil galar. Chan eil 20E a thig bho bhoireannaich ag adhbhrachadh freagairt feise, ach leigidh e le daoine fa leth a tha a’ suirghe uighean a bhreith às deidh casg a chuir air kinases a tha a’ bacadh 20E. Tha aithneachadh an hormona steroid biastag sònraichte seo do fhireannaich agus a dhreuchd ann a bhith a’ riaghladh gabhaltachd feise boireann, torachas agus eadar-obrachadh le Plasmodium a’ moladh gum faodadh e soirbheachas gintinn mosgìotothan a tha a’ sgaoileadh malaria a lughdachadh.
Tha cùisean is bàsan malaria a’ dol am meud a-rithist4 air sgàth strì an aghaidh meanbh-bhiastagan ann am mosgìotothan Anopheles, an aon vectar a bhios a’ sgaoileadh dìosganaich malaria daonna. Tha bith-eòlas suirghe nam mosgìotothan seo na thargaid gu sònraichte tarraingeach airson eadar-theachdan ùra airson smachd a chumail air malaria leis nach eil boireannaich a’ suirghe ach aon uair5; bhiodh comas mòr ann gum biodh an tachartas suirghe singilte seo neo-thorrach a’ lughdachadh àireamhan mosgìotothan san raon.
Bidh boireannaich a’ fàs neo-chomasach gu feise às deidh dhaibh hormonaichean steroid àrd-titre fhaighinn bho fhir. Tha sgrùdaidhean air sealltainn gur e 20-hydroxyecdysone (20E), hormone steroid a tha nas aithnichte mar riaghlaiche a’ chearcall leaghaidh aig ìre an larbha, an adhbhar airson duilgheadas ann am pòsadh nas fhaide. Tha comas fhireannaich 20E a cho-chur agus a ghluasad air a thighinn air adhart gu sònraichte ann an gnèithean Anopheles a tha nam pàirt den fho-ghnè Cellia7, a tha air a sgaoileadh ann an Afraga agus a tha a’ toirt a-steach na vectaran malaria as cunnartaiche, nam measg Anopheles gambiae. Tha seo gu sònraichte cudromach leis gu bheil boireannaich anns na gnèithean sin cuideachd a’ dèanamh 20E às deidh gach biadh fala, agus bidh 20E a’ stiùireadh cearcall oogenesis (faic ref. 8). Ach, chan eil mòran fiosrachaidh againn mun dòigh anns a bheil boireannaich ag amalachadh comharran bho dhà thùs eadar-dhealaichte de ecdysone (gluasad fireann agus brosnachadh biadhaidh fala) gun a bhith a’ cur bacadh air an comas fhèin pòsadh. Gu dearbh, ma bhrosnaicheas an 20E a bhios na boireannaich a’ brosnachadh neo-fhulangas feise, bidh seo a’ leantainn gu neo-thorrachas ann an daoine a bhios ag ithe òigh, giùlan gu math cumanta anns na mosgìotothan sin5.
Is e mìneachadh a dh’ fhaodadh a bhith ann gu bheil fireannaich A. gambiae a’ gluasad ecdysone atharraichte sònraichte do fhireannaich, a bhios a’ gnìomhachadh sreath chomharran anns an t-slighe gintinn boireann, agus mar thoradh air sin tha neo-sheasmhachd suirghe ann. Ach, ged a tha iomadh hormona steroid aig veirteabraich, leithid estrogen agus androgen (air ath-sgrùdadh ann an iomradh 9), cho fad ’s as aithne dhuinn, chan eil steroids le claonadh androgenic air an comharrachadh ann am biastagan.
Shuidhich sinn a-mach gus faighinn a-mach dè an stòras de hormonaichean steroid a bha ann an gland taiceil fireann (MAG) A. gambiae a bha aibidh gu feise, a’ lorg steroids atharrachail a dh’ fhaodadh a bhith ann. Le bhith a’ cleachdadh cromatagrafaidheachd leaghaidh àrd-choileanaidh còmhla ri speactramaitreachd mais tandem (HPLC-MS/MS) seach an dòigh nach robh cho sònraichte a chaidh a chleachdadh roimhe, lorg sinn ecdysone (E) agus 20E san stuth seo, a’ dearbhadh an toraidh roimhe. Ach, b’ e steroids fosfarailte oxidichte a bu mhotha a bha san sampall, a rèir na foirmle 3-dehydro-20E-22-phosphate (3D20E22P)12 (Figear 1). Am measg chruthan eile tha 3-dehydro-20E (3D20E) agus 20E-22-phosphate (20E22P). Bha dian comharra HPLC-MS/MS 3D20E22P dà ​​òrdugh meudachd nas àirde na an cruth dì-fhosfarailte aige, 3D20E, agus trì òrdughan meudachd nas àirde na E agus 20E (Figear 1). Ged a tha e ann am pàirtean eile den bhodhaig agus an... slighe gintinn ìosal (LRT; Dàta Leudaichte Fig. 1a). Rinn sinn mion-sgrùdadh cuideachd air ecdysteroids ann an fireannaich is boireannaich a chaidh a dhùnadh às ùr (<1 latha a dh'aois) agus lorg sinn 3D20E agus 3D20E22P ann am MAG a-mhàin; bha E, 20E agus 20E22P an làthair anns an dà ghnè (Dàta Leudaichte Fig. 1b). Tha an dàta seo a’ moladh gu bheil fireannaich inbheach A. gambiae a’ toirt a-mach tiotalan àrda de hormonaichean atharrachail anns na MAGn aca nach eil air an co-chur le boireannaich.
Chaidh MAG agus LRT boireann (a’ gabhail a-steach atria, vesicles seminal, agus parovarium) a sgaradh bho fhireannaich òigh 4 latha a dh'aois (4 latha a dh'aois) agus boireannaich òigh is pòsta (0.5, 3, agus 12 hpm). Chaidh Ecdysone anns na figheagan seo a sgrùdadh le HPLC-MS/MS (mean ± sem; deuchainn-t neo-phàraichte, dà-thaobhach, ìre lorg meallta (FDR) air a cheartachadh; NS, gun a bhith cudromach; *P < 0.05, **P < 0.01. 3D20E: 3 uairean an aghaidh 0.5 uairean, P = 0.035; 12 uairean an aghaidh 3 uairean, P = 0.0015; 12 uairean an aghaidh 0.5 uairean, P = 0.030. 3D20E22P: 3 uairean an aghaidh 0.5 uairean, P = 0.25; 12 uairean an aghaidh 3 uairean, P = 0.0032; 12 uair an aghaidh 0.5 uair, P = 0.015). Tha an dàta bho thrì ath-aithrisean bith-eòlasach. Chaidh farsaingeachd na mullaich airson gach ecdysone a bha fo cheist obrachadh a-mach agus a dhèanamh àbhaisteach a rèir àireamh nam mosgìotothan. Tha Ecdysone air a riochdachadh le dath mar a leanas: E, uaine; 20E, orains; 20E22P, purpaidh; 3D20E, gorm; 3D20E22P, pinc. Tha an dealbh-cuibhreachaidh a’ meudachadh an sgèile air an y-axis gus ìrean ecdysone nas ìsle a shealltainn.
Gus sgrùdadh a dhèanamh a bheil 3D20E22P agus 3D20E air an gluasad rè suirghe, rinn sinn sgrùdadh air LRTan boireann aig diofar amannan às deidh suirghe. Ged nach deach ecdysone a lorg ann am maighdeanan, chunnaic sinn meudan mòra de 3D20E22P san LRT dìreach às deidh suirghe (0.5 uair às deidh suirghe, hpm), a’ lùghdachadh thar ùine, agus ìrean 3D20E ag àrdachadh gu mòr (Figear 1). A’ cleachdadh 3D20E air a cho-chur gu ceimigeach mar inbhe, cho-dhùin sinn gu robh ìrean an hormona steroid seo ann an LRTan suirghe co-dhiù 100 uair nas àirde na 20E (Clàr Dàta Leudaichte 1). Mar sin, is e 3D20E22P am prìomh ecdysone fireann a thèid a ghluasad chun LRT boireann rè suirghe, agus bidh an cruth dì-fhosfarailte aige, 3D20E, a’ fàs gu math pailt goirid às deidh suirghe. Tha seo a’ moladh dreuchd chudromach airson an ecdysone mu dheireadh ann am bith-eòlas boireann às deidh suirghe.
Às dèidh dhuinn seata dàta ùr sreath RNA (RNA-seq) a chruthachadh (Figear 2a), a’ cleachdadh loidhne-phìoban bith-fhiosrachaidh a chaidh a thogail a dh’aon ghnothach, rannsaich sinn airson ecdysone kinase (EcK), ecdysone oxidase (EO), agus ecdysone a’ còdachadh gine phosphatase atharraichte 20E. Tha EPP) air a chur an cèill ann an clò gintinn. Chomharraich sinn aon ghine EPP tagraiche agus dà ghine EcK a dh’fhaodadh a bhith ann (EcK1 agus EcK2), ach cha b’ urrainn dhuinn gine EO tagraiche math a lorg. Gu sònraichte, chaidh ginean EPP fa leth a chur an cèill aig ìrean àrda (98.9mh ceudad) ann am MAGan Gambian ach chan ann an LRTan boireann (Figear 2b), an aghaidh ar dùilean leis gun do thachair dì-fhosphorylation de 3D20E22P anns an stuth boireann seo. Mar sin, tha sinn a’ creidsinn gum faodadh EPP fireann a bhith air a ghluasad rè suirghe. Gu dearbh, chleachd sinn bileagan isotope seasmhach in vivo gus am pròtain boireann a fhalach às deidh suirghe, enzyme a chaidh a chomharrachadh le MS anns an atrium boireann (Figear 2c agus Clàr Taiceil 1). Làthaireachd Chaidh EPP ann am MAG agus LRT boireann pòsta (ach chan e òigh) a dhearbhadh cuideachd le bhith a’ cleachdadh antibodies sònraichte (Figear 2d).
a, Pìob-loidhne bith-fhiosrachaidh a chaidh a thogail a dh’aon ghnothach gus sgrùdadh a dhèanamh air clò gintinn gach gnè airson ginean a tha a’ còdachadh EcKs, EOs, agus EPPs. Tha na h-àireamhan ri taobh nan saighdean a’ comharrachadh àireamh nan tagraichean fireann is boireann aig gach ceum. Chomharraich an anailis seo aon ghine EPP (EPP) agus aon ghine EcK (EcK1) a tha air an cur an cèill ann an fireannaich, agus aon ghine EcK (EcK2) a tha air a chur an cèill anns an dà ghnè ach nach eil a’ toirt a-mach gine EO tagraiche. b, Mapa teas a’ dèanamh coimeas eadar abairt gine tagraiche ann am clò Anopheles gambiae maighdean (V) agus figheagan suirghe (M). Spca, torrachadh; MAGs, fàireagan taiceil ann an fireannaich; pàirtean eile den bhodhaig, a’ gabhail a-steach cìochan, sgiathan, casan, cuirp reamhar, agus buill-bodhaig a-staigh anns an dà ghnè, agus ubhlan ann am boireannaich. Tha EcK2 air a chur an cèill gu mòr an dà chuid ann am MAG agus atria Gambia, ach chan fhaighear EPP ach ann am MAG.c, Mion-sgrùdadh proteomic air gluasad buidhne ejaculate fireann gu atria boireann aig 3, 12 agus 24 hpm, a’ sealltainn na 67 pròtainean as pailte. Chaidh boireannaich a thogail air daithead anns an robh 15N gus na pròtainean uile a chomharrachadh (agus a mhasgadh). Chaidh fireannaich gun tag a phòsadh le boireannaich le tag, agus chaidh LRTan boireann a sgaradh aig 3, 12 agus 24 hpm airson mion-sgrùdadh proteomic (faic Clàr a bharrachd 1 airson liosta iomlan de phròtainean ejaculatory). Inset, chaidh EPP, Eck1 agus EcK2 a lorg ann am MAG fhireannaich òigh le mion-sgrùdadh proteomic air na figheagan sin.d, chaidh EPP a lorg le blot an iar ann am MAG agus LRT boireannaich a chaidh a phòsadh, ach chan ann am boireannaich no fireannaich òigh no a’ chòrr de chorp boireann. Chaidh membranan a sgrùdadh aig an aon àm air a dhearbhadh le antibodies an-aghaidh actin (smachd luchdaidh) agus antibodies an-aghaidh EPP. Tha a h-uile fireannach nan òighean. Faic Figear Taiceil 1 airson dàta stòr gel. Chaidh blots an Iar a dhèanamh dà uair le toraidhean coltach ris.
Chaidh gnìomhachd ecdysteroid phosphophosphatase EPP a dhearbhadh às dèidh goinneadaireachd le HPLC-MS/MS le 3D20E22P air a sgaradh bho MAG (Dàta Leudaichte Fig. 2a). A bharrachd air an sin, nuair a chuir sinn stad air EPP le eadar-theachd le RNA (RNAi), lorg sinn lùghdachadh làidir ann an gnìomhachd phosphatase ann am figheagan gintinn nan fireannaich sin (Figear 3a), agus sheall boireannaich a chaidh a chàradh le fireannaich air an robh EPP air an tostachadh cuibhreann nas ìsle de 3D20E dì-fhosfarailte (Figear 3b) a dh’ aindeoin tostachadh gine pàirteach (Dàta Leudaichte Fig. 2b,c). An coimeas ri sin, cha do lorg sinn atharrachaidhean mòra anns a’ cho-mheas 20E22P/20E anns na h-aon mosgìotothan, a dh’ fhaodadh a bhith a’ moladh gu bheil an enzyme sònraichte airson 3D20E22P (Figear 3b).
a, Lùghdachadh ann an gnìomhachd fosfatase ann am MAG air adhbhrachadh le bhith a’ tostachadh EPP a’ cleachdadh smachdan RNA EPP dà-shreathach (dsEPP) no RNA GFP dà-shreathach (dsGFP). Chaidh fichead amar MAG a chleachdadh anns gach mac-samhail (P = 0.0046, deuchainn-t càraideach, dà-thaobhach), air an riochdachadh le dotagan fa leth.b, Bha cuibhreann mòran nas ìsle de 3D20E dì-fhosfarailichte aig boireannaich a chaidh a chàradh le fireannaich air an robh EPP air an tostachadh aig 3 hpm (P = 0.0043, deuchainn-t gun chàraid, dà-thaobhach), ach cha robh buaidh sam bith air ìrean 20E (P = 0.063, gun chàraid). deuchainn-t, dà-thaobhach). Tha dàta air a thaisbeanadh mar chuibheasachd ± sem bho thrì buidhnean de 13, 16 agus 19 boireannaich anns gach fear.c, Bha ìrean ath-chàraideachaidh gu math nas àirde aig boireannaich a chaidh a phòsadh le fireannaich air an robh EPP sàmhach (P = 0.0002, deuchainn mionaideach Fisher, dà-thaobhach). Chaidh boireannaich a sparradh an toiseach gu pòsadh gus dèanamh cinnteach à an inbhe pòsaidh; 2 latha às dèidh sin, chaidh fios a chur thuca le fireannaich eile aig an robh sperm tar-ghinte gus measadh a dhèanamh air ìrean ath-chàraideachaidh le bhith a’ lorg PCR cainneachdail an tar-ghinte.d, Bha torrachas air a lùghdachadh gu mòr aig boireannaich air am biathadh le fuil a chaidh a chàradh le fireannaich air an robh EPP air an sàmhachd (P < 0.0001; deuchainn Mann-Whitney, dà-thaobhach) agus àireamh uighean beagan air a lùghdachadh (P = 0.088, deuchainn Mann-Whitney, dà-thaobhach), agus cha robh buaidh aig an ìre sìolachaidh (P = 0.94, deuchainn mionaideach Fisher, dà-thaobhach).Anns a h-uile pannal, tha n a’ riochdachadh an àireamh de shampaill mosgìoto a bha neo-eisimeileach gu bith-eòlasach.NS, gun a bhith cudromach.*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.001.
An ath rud, rinn sinn measadh a bheil dì-fhosfaraileachadh ecdysone cudromach airson strì an aghaidh suirghe a bhrosnachadh ann am boireannaich. Gu sònraichte, rinn boireannaich a chaidh suirghe le fireannaich air an robh EPP air a thoirt air falbh ath-suirghe aig tricead mòran nas àirde (44.9%) na boireannaich smachd (10.4%) nuair a chaidh an nochdadh do fhireannaich a bharrachd (tar-ghineach) (Figear 3c). Chunnaic sinn cuideachd lùghdachadh mòr ann an torachas (Figear 3d, clì) agus lùghdachadh beag ann an àireamh nan uighean a chuir na boireannaich sin sìos (Figear 3d, meadhan), agus cha deach buaidh a thoirt air ceudad nan uighean a chuir boireannaich sìos (freagairt eile a chaidh a bhrosnachadh ann am boireannaich le suirghe)) (Figear 3d, deas). Leis cho sònraichte sa tha EPP a chaidh fhaicinn airson 3D20E22P, tha na toraidhean seo a’ moladh gum faodadh pàirt chudromach a bhith aig gnìomhachadh 3D20E le EPP a chaidh a ghluasad rè suirghe ann a bhith a’ tionndadh dheth gabhaltachd boireannaich ri suirghe a bharrachd, giùlan a chaidh a chur roimhe seo mar thoradh air gluasad gnèitheasach 20E. Mar sin, tha an hormone sònraichte fireann seo cuideachd a’ toirt buaidh mhòr air torachas boireannaich.
An ath rud, rinn sinn coimeas eadar gnìomhachd 20E agus 3D20E ann an deuchainnean stealladh ann am maighdeanan aibidh gu feise a’ cleachdadh 3D20E air a cho-chur gu ceimigeach (Figear 4a–c) agus 20E a tha ri fhaighinn gu malairteach. Chunnaic sinn gu robh 3D20E gu math nas èifeachdaiche na 20E ann a bhith a’ dùnadh cugallachd boireann ri suirghe aig an dà cho-chruinneachadh (Figear 4d). Gu sònraichte, dh’ adhbhraich leth na h-ìre fiseòlasach de 3D20E anns an LRT (1,066 pg às dèidh stealladh an aghaidh 2,022 pg às dèidh suirghe) cuibhreann de bhoireannaich teasfhulangach a bha 20 uiread nas àirde na an ìre fiseòlasach de 20E (361 pg às dèidh stealladh) 24 uair às dèidh stealladh aig an dùmhlachd as àirde 18 pg às dèidh suirghe; Clàr Dàta Leudaichte 1). Tha an toradh seo a’ co-chòrdadh ris a’ bheachd nach eil gluasad feise 20E ag adhbhrachadh amannan teasfhulangach suirghe, agus a’ comharrachadh tuilleadh gu 3D20E mar phrìomh fheart ann a bhith a’ dèanamh cinnteach à dàimh pàrant-cloinne. Bha 3D20E cuideachd gu math nas gnìomhaiche na 20E ann an deuchainnean breith uighean ann am boireannaich òigh (Figear 4e), a’ moladh gur ann mar thoradh air làthaireachd gnìomhachd 3D20E a bha fhathast air fhàgail le factaran boireann air an adhbhrachadh le suirghe a bha an ìre breith uighean àbhaisteach a chunnaic sinn às deidh fois a ghabhail ann an EPP.
(a,b) 3D20E air a cho-chur gu ceimigeach bho 20E (a) le tionndadh/èifeachdas glè àrd (dàta air a thaisbeanadh mar chuibheasachd ± sem bho thrì ath-bheachdan co-chur neo-eisimeileach) (b).c, Tha an speactram mais (leth ìosal) dìreach a’ maidseadh ecdysone a lorgar ann an LRT boireann pòsta (leth àrd).d, An coimeas ri 20E (0.63 µg, P = 0.02; 0.21 µg, P < 0.0001; deuchainn mionaideach Fisher, dà-thaobhach) agus 10% ethanol (0.63 µg, P < 0.0001; 0.21 µg, P < 0.0001; deuchainn mionaideach Fisher, dà-thaobhach), agus bha 20E gu math nas àirde na smachd aig dòsan nas àirde a-mhàin (0.63 µg, P = 0.0002; 0.21 µg, P = 0.54; deuchainn mionaideach Fisher, dà-thaobhach).e, 3D20E Dh’adhbhraich stealladh ìrean sìolachaidh mòran nas àirde ann am boireannaich òigh na smachdan 10% ethanol (0.21 µg, P < 0.0001; 0.13 µg, P = 0.0003; deuchainn mionaideach Fisher, dà-thaobhach), agus 20E an coimeas ri smachdan a-mhàin aig dòsan nas àirde (0.21 µg, P = 0.022; 0.13 µg, P = 0.0823; deuchainn mionaideach Fisher, dà-thaobhach). Dh’adhbhraich 3D20E ìrean sìolachaidh mòran nas àirde na 20E aig dòsan nas àirde (0.21 µg, P = 0.0019; 0.13 µg, P = 0.075; deuchainn mionaideach Fisher, dà-thaobhach). Anns a h-uile pannal, tha n a’ riochdachadh an àireamh de shamhlaichean mosgìoto neo-eisimeileach gu bith-eòlasach. NS, gun a bhith cudromach. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.001. Tha an dàta bho trì leth-bhreacan.
Ann an sgrùdaidhean roimhe, cho-dhùin sinn gu bheil gluasad gnèitheasach hormonaichean steroid ag adhbhrachadh abairt MISO (Mating-Induced Stimulator of Oogenesis 11), gine gintinn boireann a dhìonas boireannaich A. gambiae bho ghalar P. falciparum Cosgaisean slàinte air adhbhrachadh le 13, am parasite malaria daonna as marbhtaiche. Leis cho cudromach sa tha MISO do shlàinte gintinn Anopheles ann an sgìrean malaria-endemic, cho-dhùin sinn faighinn a-mach dè an hormone 3D20E no 20E a bhrosnaicheas abairt a’ ghine seo. Fhuair sinn a-mach, ged a bhrosnaich stealladh 20E gu sònraichte no nas cumhachdaiche cuid de gabhadairean hormona niùclasach (HR), leithid HR3 agus HR4, agus targaidean steroid àbhaisteach sìos an abhainn, leithid na ginean yologenic Vg14, 15, 16, gun robh MISO nas làidire air a bhrosnachadh le 3D20E (Figear Dàta Leudaichte 3). Mar sin, tha e coltach gu bheil gluasad gnèitheasach an hormona steroid androgenic seo ag adhbhrachadh dhòighean-obrach a dhìonas boireannaich bho na cosgaisean a tha an lùib galar parasite. A bharrachd air an sin, tha buaidh eadar-dhealaichte aig 3D20E air an dà isoforms den gabhadair E EcR, ag adhbhrachadh EcR-A agus a’ cur bacadh air EcR-B, agus a’ brosnachadh ginean eile a bhios ag adhbhrachadh suirghe nas làidire, nam measg HPX15, a bheir buaidh air torachas boireann. Dh’ fhaodadh seo mìneachadh a dhèanamh air an neo-thorrachas mòr a chithear ann am boireannaich a chaidh a suirghe le fireannaich air an robh EPP sàmhach (Dàta Leudaichte Figear 3). Tha an dàta seo a’ moladh gu bheil slighean sìos an abhainn ann a bhios air an gnìomhachadh gu roghnach le dà hormona ecdysone a dh’ fhaodadh a bhith aig bonn gnìomh sònraichte don ghnè.
An ath rud, rinn sinn deuchainn air gnìomh an dà ghine EcK a chaidh an comharrachadh anns a’ phìob-loidhne bith-fhiosrachaidh againn. Dh’ adhbhraich cuir às do EcK1 no EcK2 bàsmhorachd mhòr ann an fireannaich (Dàta Leudaichte Figear 4a), a’ moladh gu bheil fosfaireachadh ecdysone, agus mar sin dì-ghnìomhachadh, cudromach airson mairsinn beò. Leis gun deach EcK2 a chuir an cèill aig ìrean nas àirde na EcK1 agus gun deach a lorg ann am MAGn le proteomics (Figear 2b, c agus Clàr-taice 2), dhearbh sinn a ghnìomhachd ecdysteroid kinase le bhith ga ghoir le 20E, a lean gu fosfaireachadh 20E22P (Dàta Leudaichte Figear 2).4b). Nuair a bha sinn a’ cleachdadh 3D20E mar fho-strat, cha b’ urrainn dhuinn an toradh fosfairichte 3D20E22P a lorg (Dàta Leudaichte Figear 4c), a’ moladh gur dòcha gur e 20E seach 3D20E an targaid as fheàrr le EcK2.
A rèir ar mion-sgrùdadh RNA-seq, bha EcK2 cuideachd air a chur an cèill gu mòr ann an LRT boireannaich òigh, far an deach a chuir dheth às deidh suirghe (Figear 2b). Dhearbh sinn an dàta seo agus cho-dhùin sinn nach robh buaidh aig biathadh fala air abairt EcK2 (Dàta Leudaichte Figear 5a). A’ leudachadh ar deuchainnean MS tùsail, cho-dhùin sinn gu robh àirde 20E22P dlùth-cheangailte ri àirde 20E (22-26 uair às deidh biadh fala; Dàta Leudaichte Figear 5b). Mar thoradh air cuir às do EcK2 ann am boireannaich òigh, chaidh co-mheas 20E gu 20E22P a mheudachadh trì uiread aig 26 uair às deidh biadh fala (Figearan Dàta Leudaichte 2c agus 5c), a’ dearbhadh gu bheil EcK2 cuideachd a’ fosfaraileadh 20E ann am boireannaich. Gu sònraichte, chùm maighdeanan air an robh EcK2 air a lughdachadh làn ghabhaltas feise (Dàta Leudaichte Figear 5d,e), a’ moladh cuideachd nach eil cinneasachadh 20E aig boireannaich ag adhbhrachadh amannan teasfhulangach suirghe. Ach, bha na boireannaich sin gu mòr… ìrean breith uighean nas àirde an taca ris a’ bhuidheann smachd, le còrr air 30% de mhaighdeanan a’ breith uighean (Figear Dàta Leudaichte 5f). Mura deach stealladh RNA Eck2 dà-shreath (dsEcK2) a dhèanamh an dèidh biathadh le fuil, cha do thachair sìolachadh, agus aig an ìre sin bha am bàrr 20E mar thoradh air in-ghabhail fala air tuiteam. Gu h-iomlan, tha na toraidhean seo a’ toirt taic do mhodail gum faod 20E a thèid a thoirt a-mach às deidh suirghe fala sìolachadh adhbhrachadh, ach dìreach nuair a thèid am bacadh sìolachaidh (EcK2 agus is dòcha factaran eile) a chuir dheth le bhith a’ suirghe. Cha do chuir stealladh 20E no 3D20E bacadh air abairt EcK2 ann am maighdeanan (Figear Dàta Leudaichte 5g), a’ moladh gu bheil factaran eile a’ meadhanachadh casg a’ chinase seo. Ach, cha robh ìrean 20E an dèidh biathadh le fuil gu leòr airson mì-chofhurtachd suirghe adhbhrachadh, ach chaidh an spreagadh gu h-èifeachdach le titers àrda de 3D20E a chaidh a ghluasad gu feise.
Tha na toraidhean againn a’ toirt sealladh cudromach air na dòighean a bhios a’ riaghladh soirbheachas gintinn A. gambiae. Tha modail air nochdadh far a bheil fireannaich air mean-fhàs gus teatairean àrda de 3D20E a cho-chur, ecdysone atharraichte sònraichte do fhireannaich a nì cinnteach à pàrantachd le bhith a’ dì-mhothachadh boireannaich gu barrachd suirghe. Aig an aon àm, tha na vectaran malaria seo cuideachd air siostam èifeachdach a leasachadh gus 3D20E a ghnìomhachadh ann am boireannaich mar fhreagairt do ghluasad gnèitheasach EPP sònraichte do fhireannaich. Cho fad ‘s as aithne dhuinn, is e seo a’ chiad eisimpleir de shiostam hormona steroid fo smachd fhireannaich is bhoireannaich a’ coileanadh gnìomh sònraichte agus deatamach ann am biastagan. Tha gnìomh ecdysone sònraichte do fhireannaich air a phostadh ach cha deach a dhearbhadh gu deimhinnte. Mar eisimpleir, is e beachd-bharail a chaidh a dhearbhadh gu ìre mhòr 18 gum faodadh na gnìomhan sin a bhith air an coileanadh leis an ro-ruithear 20E E1. Tha fios gu bheil monandry air a bhrosnachadh ann an Drosophila le gluasad gnèitheasach peptides beaga gnè 19,20 a bhios ag eadar-obrachadh le neurons a’ toirt a-steach slighe gintinn boireann tro gabhadan peptide gnè sònraichte 21,22. Tha feum air tuilleadh obrach gus an comharradh sìos an abhainn a dhearbhadh. easan fo smachd 3D20E ann am boireannaich A. gambiae agus gus faighinn a-mach an gabh na easan sin a ghleidheadh ​​eadar mosgìotothan agus Drosophila.
Leis cho cudromach sa tha 3D20E ann an torachas is giùlan boireann a chaidh a chomharrachadh san sgrùdadh againn, tha na slighean a tha a’ leantainn gu co-chur is gnìomhachadh 3D20E a’ tabhann chothroman ùra airson ro-innleachdan smachd mosgìoto san àm ri teachd, leithid gineadh fhireannaich steirile farpaiseach ann an ro-innleachdan teicneòlais bhiastagan steirile. Cleachdadh airson leigeil ma sgaoil fiadhaich no gus atharrais a dhèanamh air an 3D20E ann an cluich òigh. Is dòcha gun do dh’fhàs gnìomh sònraichte do fhireannaich 3D20E nuair a fhuair A. gambiae agus gnèithean Cellia eile an comas an seamhan a chruinneachadh gu plugaichean suirghe, oir leigidh seo le gluasad èifeachdach àireamh mhòr de hormonaichean agus einnseanan gnìomhachaidh hormona. An uair sin, tha mean-fhàs 3D20E a’ cur an gnìomh monandry a’ toirt seachad dòigh airson boireannaich (tro bhith a’ cur an cèill gu mòr MISO) gus am fallaineachd gintinn a bhrosnachadh ann an sgìrean le tricead àrd malaria, a tha gu neo-dhìreach a’ cur ri sgaoileadh Plasmodium. Leis gu bheil e air a shealltainn gu bheil buaidhean mòra aig 20E boireann air mairsinneachd is fàs P. falciparum ann am mosgìotothan boireann Anopheles,24 tha slighean hormona steroid fireann is boireann a-nis nan taobhan cudromach de eadar-obrachadh mosgìoto-parasite.
Chaidh sreathan G3 de A. gambiae àrach fo chumhachan àbhaisteach bhiastagan (26-28 °C, taiseachd coimeasach 65-80%, ùine solais/dorchadas 12:12 uair). Chaidh biadh èisg pùdarrach (TetraMin Tropical Flakes, Koi Pellets agus Tetra Pond Sticks) a bhiadhadh do na larbha ann an co-mheas 7:7:2). Chaidh fuasgladh dextrose 10% agus fuil daonna gach seachdain (sgrùdadh co-phàirtean fala) a bhiadhadh ad libitum do mosgìotothan inbheach (farsaingeachd air co-phàirtean fala). Fhuaireadh mosgìotothan òigh le bhith a’ sgaradh nan gnèithean aig ìre a’ phupain an dèidh sgrùdadh a dhèanamh air na cinn le microscopy. Chaidh cunntas a thoirt air fireannaich a bha a’ giùlan an transgene DsRed roimhe seo.
Chaidh deuchainnean suirghe èignichte a dhèanamh a rèir phròtacalan a chaidh a mhìneachadh roimhe. Airson suirghe nàdarrach, chaidh boireannaich òigh 4 latha a dh'aois a chumail ann an co-mheas 1:3 le fireannaich òigh aibidh gu feise airson dà oidhche. Airson deuchainnean anns an deach fireannaich a stealladh le dsEPP, bha an co-chèidseadh a’ tighinn aig an aon àm ri làithean 3-4 às dèidh an stealladh, nuair a bha gnìomhachd phosphatase aig a’ char as àirde (Figear Dàta Leudaichte 2b).
Chaidh clò nam mosgìotothan, na cuirp a bha air fhàgail (an còrr den bhodhaig), no an corp gu lèir a sgaradh a-mach ann an 100% methanol agus an co-dhèanamh le inneal-grìogagan (grìogagan glainne 2 mm, 2,400 rpm, 90 diog). Bha meudan clò agus meudan methanol mar a leanas: an còrr den bhodhaig, 50 ann an 1,000 µl; MAG, 50–100 80 µl; LRT boireann, 25–50 80 µl. Chaidh an deascadh a thoirt fo dhàrna às-tharraing methanol leis an aon mheud de methanol. Chaidh sprùilleach cealla a thoirt air falbh le bhith ga shnìomh-chriathradh. Chaidh am methanol bho gach às-tharraing a chur còmhla agus a thiormachadh fo shruth naitridein, agus an uairsin ath-fhuadachadh anns na meudan a leanas de 80% methanol ann an uisge: an còrr den bhodhaig, 50 µl; MAGan agus LRT boireann, 30 µl.
Chaidh sampallan a sgrùdadh air speactrometer mais (ID-X, Thermo Fisher) ceangailte ri inneal LC (Vanquish, Thermo Fisher). Chaidh 5 µl den sampall a stealladh a-steach do cholbh 3 µm, 100 × 4.6 mm (Inspire C8, Dikma) air a chumail aig 25 °C. B’ e na h-ìrean gluasadach airson an LC A (uisge, 0.1% searbhag formach) agus B (acetonitrile, 0.1% searbhag formach). Bha an caisead LC mar a leanas: 5% B airson 1 mionaid, an uairsin air a mheudachadh gu 100% B thairis air 11 mionaidean. Às deidh 8 mionaidean aig 100%, ath-chothromaich an colbh aig 5% B airson 4 mionaidean. B’ e an ìre sruthadh 0.3 ml min-1. Tha ianachadh anns an stòr MS air a choileanadh le ianachadh electrospray teasachaidh ann am modhan adhartach agus àicheil.
Bidh an speactrometer mais a’ tomhas dàta anns an raon m/z bho 350 gu 680 aig rùn 60,000 ann am modh MS slàn. Chaidh dàta MS/MS fhaighinn air [M + H]+ (na targaidean uile), [M - H2O + H]+ (na targaidean uile), agus [M - H]- (targaidean fosfarailichte). Chaidh dàta MS/MS a chleachdadh gus dearbhadh a dhèanamh air feartan ecdysone nan targaidean nach robh inbhe ri fhaighinn air an son. Gus ecdysteroids neo-thargaideach a chomharrachadh, chaidh dàta MS/MS airson a h-uile mullach HPLC le pailteas coimeasach >15% a sgrùdadh. Meudaich le bhith a’ cleachdadh lùban àbhaisteach a chaidh a chruthachadh bho inbhean fìor-ghlan (20E, 3D20E) gus meudan iomlan no caolachaidhean aon sampall sònraichte (na targaidean eile uile) obrachadh a-mach gus an co-ionannachd ris na meudan a lorgar ann an aon fhireannach obrachadh a-mach. Airson 3D20E, chaidh tomhas a dhèanamh le bhith a’ cleachdadh suim nan adducts a leanas: [M + TFA]-, [M + COOH]-, [M + Na]+, [M + Cl]-, [M + NO3]-.Chaidh dàta a thoirt a-mach agus a thomhas le bhith a’ cleachdadh Tracefinder (dreach 4.1).Chaidh dàta MS/MS a sgrùdadh le bhith a’ cleachdadh Xcalibur (dreach 4.4).Chaidh speactraman MS E, 20E agus 3D20E a choimeas ris na h-inbhean fa leth.Chaidh 3D20E22P a sgrùdadh le bhith ga chruthachadh le riochdaire Girard.Chaidh 20E22P a sgrùdadh a rèir co-mheas m/z.
Chaidh 3D20E22P a ghlanadh bho MAG. Chaidh an glanadh a dhèanamh air sgèile anailis le bhith a’ cleachdadh cromatagraf leaghaidh ultra-choileanaidh (Acquity, Waters) le lorgaire stèidhichte air mais ceithir-phòla (QDa, Acquity, Waters) fo na h-aon chumhachan LC ris an anailis HPLC-MS/MS. Chaidh cruinneachadh bloigh a bhrosnachadh nuair a chaidh an m/z a bha co-fhreagarrach ri 3D20E22P a lorg aig an aon ùine gleidhidh ris an deach a dhearbhadh roimhe. Chaidh purrachd nan todhar a chaidh a thoirt a-mach an uairsin a sgrùdadh le HPLC-MS/MS mar a chaidh a mhìneachadh gu h-àrd.
Chaidh RNA iomlan a thoirt a-mach à 10-12 clò gintinn no pàirtean eile den bhodhaig (gun cheann) a’ cleachdadh ath-bhualadair TRI (Thermo Fisher) a’ leantainn stiùiridhean an neach-dèanamh. Chaidh RNA a làimhseachadh le TURBO DNase (Thermo Fisher). Chaidh cDNA a cho-chur ri chèile a’ cleachdadh transcriptase cùil bhìoras leucemia luchag Moloney (M-MLV RT; Thermo Fisher) a’ leantainn stiùiridhean an neach-dèanamh. Chaidh prìomhairean airson PCR cainneachdail tar-sgrìobhaidh cùil (RT-qPCR; Clàr Dàta Leudaichte 2) fhoillseachadh roimhe seo24 no a dhealbhadh a’ cleachdadh Primer-BLAST26, le roghainn air a thoirt do thoraidhean de 70-150 bp ann am meud agus a’ dol thairis air snaimean exon-exon no bidh prìomhairean paidhir Primer a’ sgaradh exons. Chaidh sampallan cDNA bho thrì gu ceithir ath-aithrisean bith-eòlasach a chaolachadh ceithir-fhillte ann an uisge airson RT-qPCR. Chaidh tomhas a dhèanamh ann an ath-bheachdan ath-aithris 15 µl anns an robh 1 × PowerUp SYBR Green Master Mix (Thermo Fisher), prìomhairean, agus 5 µl de cDNA caolaichte. Chaidh ath-bheachdan a ruith air QuantStudio 6 Pro fìor-ùine. Chaidh siostam PCR (Thermo Fisher) agus dàta a chruinneachadh agus a sgrùdadh a’ cleachdadh Dealbhadh is Mion-sgrùdadh (dreach 2.4.3). Mar a chithear san sgrùdadh seo, chaidh meudan coimeasach a dhèanamh àbhaisteach don ghine ribosomal RpL19 (AGAP004422), nach do dh’atharraich an abairt aige gu mòr le biathadh fala 27 no suirghe 3 .
Chaidh càileachd RNA a sgrùdadh le bhith a’ cleachdadh Agilent Bioanalyzer 2100 Bioanalyzer (Agilent). Chaidh leabharlannan càraideach Illumina ullachadh agus a ruith aig Broad Institute MIT agus Harvard. Chaidh leughaidhean sreath a cho-thaobhadh ri genome A. gambiae (strain PEST, dreach 4.12) a’ cleachdadh HISAT2 (dreach 2.0.5) le paramadairean bunaiteach. Chaidh leughaidhean le sgòran càileachd mapaidh (MAPQ) <30 a thoirt air falbh le bhith a’ cleachdadh Samtools (dreach 1.3.1). Chaidh an àireamh de leughaidhean a chaidh a mhapadh gu ginean a chunntadh le bhith a’ cleachdadh htseq-count (dreach 0.9.1) le paramadairean bunaiteach. Chaidh cunntasan leughaidh àbhaisteach obrachadh a-mach agus chaidh diofar abairt gine a sgrùdadh le bhith a’ cleachdadh am pasgan DESeq2 (dreach 1.28.1) ann an R (dreach 4.0.3).
Chaidh tagraichean gine a dh’atharraicheas ecdysone a chomharrachadh le bhith an toiseach a’ sgrùdadh genome A. gambiae a’ cleachdadh an algairim PSI-BLAST (https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/2.8.1/), a’ cleachdadh luachan bunaiteach Paramadairean leis na sreathan pròtain ceiste a leanas: bho Bombyx mori (Àireamh Inntrigidh NP_001038956.1), Musca domestica (Àireamh Inntrigidh XP_005182020.1, XP_005175332.1 agus XP_011294434.1) agus Microplitis demolitor (Àireamh Inntrigidh XP_008552646.1 agus XP_008552645.1) EcK bho B. mori (Àireamh Inntrigidh NP_001036900), Drosophila melanogaster (Àireamh Inntrigidh NP_651202), Apis mellifera (Àireamh Inntrigidh XP_394838) agus Acyrthosiphon pisum (Àireamh Inntrigidh XP_001947166); agus EPP bho B. mori (Àireamh Inntrigidh XP_001947166) NP_001177919.1 agus NP_001243996.1) agus EO de D. melanogaster (Àireamh Inntrigidh NP_572986.1) (ceum 1). An uairsin, sìolaich na toraidhean stèidhichte air abairt àrd mRNA (>100 bloigh/eacsonan kilobase gach millean leughaidh mapaichte (FPKM) no >85%) ann an clò gintinn (LRT boireann no MAG) ann an Gambia (ceum 2). Gus sònrachas a leasachadh, thagh sinn einnseanan tagraiche a tha cuideachd air an cur an cèill ann am clò gintinn A. albimanus, gnè anopheles nach bi a’ dèanamh no a’ gluasad ecdysone rè suirghe. Chaidh ginean tagraiche a shìoladh stèidhichte air abairt ìosal (<100 FPKM no <85mh ceudad) ann am clò gintinn A. albimanus (ceum 3). Mar shìoladh mu dheireadh (ceum 4), feumaidh ginean tagraiche co-dhiù aon de na leanas a shàsachadh: (1) air an àrdachadh gu mòr às deidh suirghe (P < 0.05) a rèir mion-sgrùdadh ginean air an cur an cèill gu eadar-dhealaichte agus (2) ann am clòthan neo-ghintinn (< 85% no <100 FPKM).
Mhion-atharraich sinn modhan a chaidh a mhìneachadh roimhe 28,29,30 gus bileagan isotopach slàn-fhàsach a choileanadh. Gu h-aithghearr, chaidh deuchainn a dhèanamh air Saccharomyces cerevisiae seòrsa II fiadhaich (YSC2, Sigma) ann am bunait naitridean beirm (BD Difco, DF0335) anns an robh (wt/vol) 2% glùcois (G7528, Sigma), 1.7% meadhan cultar gun amino-aigéid agus ammonium sulfate) agus 5% 15N ammonium sulfate (NLM-713, >99%, Cambridge Isotope Laboratories) mar an aon thùs naitridean. Chaidh beirm fhaighinn air ais le bhith ga centrifugachadh agus chaidh larbha mosgìoto a bhiadhadh ad libitum gus an robh iad nan pupaichean. Leasaich le min-èisg (0.5 mg gach 300 larbha) gus casg a chuir air bàsmhorachd ceathramh ìre. Cha deach ach boireannaich a chleachdadh an uairsin ann an deuchainnean suirghe le fireannaich gun bileagan gus mion-sgrùdadh a dhèanamh air a’ phròtainome fhireann a chaidh a ghluasad rè suirghe.
Chaidh boireannaich òigh 4-6 latha a dh'aois le tagaichean 15N a sparradh gus suirghe le fireannaich òigh gun tagaichean den aon aois. Chaidh dearbhadh gu robh suirghe soirbheachail ann le bhith a’ lorg plugaichean suirghe fo mhicreasgopaidh epifluorescence. Aig 3, 12, agus 24 hpm, chaidh atria 45-55 boireannaich suirghe a sgaradh a-steach do 50 µl de bufair ammonium bicarbonate (pH 7.8) agus chaidh an co-dhèanamh le pestle. Chaidh an co-dhèanamh a chuir ann an centrifuge agus chaidh an t-supernatant a mheasgachadh le 50 µl de 0.1% RapiGest (186001860, Waters) ann an 50 mM ammonium bicarbonate. Chaidh an t-supernatant agus am peileat bho gach sampall a reothadh gu sgiobalta air deigh thioram agus an cur thar oidhche gu obair-lann MacCoss aig Oilthigh Washington, far an deach ullachadh sampall airson LC-MS/MS a chrìochnachadh. Ath-shuidhich am peileat ann an 50 µl de 0.1% RapiGest ann an 50 mM ammonium bicarbonate agus sonicate ann an amar uisge. Chaidh dùmhlachd pròtain a’ pheileit agus an t-supernatant a thomhas leis an Deuchainn BCA, chaidh sampallan a lughdachadh le 5 mM dithiothreitol (DTT; Sigma), an alkylachadh le 15 mM iodoacetamide (Sigma) agus an goradh aig 37 °C (1:0 50) airson 1 uair le trypsinachadh: co-mheas trypsin:substrate). Chaidh RapiGest a lysis le bhith a’ cur 200 mM HCl ris, agus an uairsin goradh aig 37 °C airson 45 mionaidean agus centrifugachadh aig 14,000 rpm airson 10 mionaidean aig 4 °C gus sprùilleach a thoirt air falbh. Chaidh sampallan a nighe le às-tharraing ìre chruaidh dà-mhodh (cartridan Oasis MCX, Waters) agus an ath-fhulang ann an 0.1% searbhag formach airson dùmhlachd pròtain mu dheireadh de 0.33 µg µl-1. Chaidh pròtainean MAG gun lipéad a sgrùdadh san aon dòigh bho fhireannaich òigh. Chaidh dà leth-bhreac anailis a sgrùdadh airson gach sampall. An uairsin, chaidh 1 µg de gach fear a sgrùdadh a’ cleachdadh colbh silica leaghte 25-cm 75-μm le a Ribe frit Kasil1 (PQ) silica leaghte 4-cm air a phacadh le roisinn ìre-aiseig Jupiter C12 (Phenomenex) agus cromagrafaidheachd leaghaidh 180-mionaid. Cnàmhan sampall – chaidh MS/MS a ruith air speactrometer mais HF Q-Exactive (Thermo Fisher) le Siostam nanoACQUITY UPLC (Waters). Chaidh dàta togail co-cheangailte ri dàta a chaidh a chruthachadh airson gach ruith a thionndadh gu cruth mzML a’ cleachdadh Proteowizard (dreach 3.0.20287) agus a’ cleachdadh Comet31 (dreach 3.2) an aghaidh stòr-dàta FASTA anns a bheil sreathan pròtain bho Anopheles gambiae (dreach VectorBase 54), Anopheles coluzzi. Chaidh rannsachadh a dhèanamh air Mali-NIH (dreach VectorBase 54), Saccharomyces cerevisiae (Uniprot, Màrt 2021), RNA-seq A. gambiae, agus eadar-theangachaidhean trì-fhrèam de thruailleadh daonna aithnichte. Chaidh FDRan a bha co-ionnan ri mapa peptide a dhearbhadh a’ cleachdadh Percolator32 (dreach 3.05) le stairsneach de 0.01, agus chaidh peptides a chruinneachadh ann an comharrachadh pròtain a’ cleachdadh parsimony pròtain ann an Limelight33 (dreach 2.2.0).Chaidh pailteas coimeasach pròtain a mheasadh a’ cleachdadh am factar pailteas speactram àbhaisteach (NSAF) a chaidh obrachadh a-mach airson gach pròtain anns gach ruith mar a chaidh a mhìneachadh roimhe.Chaidh NSAF an coimeas ri gach pròtain a chuibheasachadh thar shampaill bho dhà ath-riochdachadh bith-eòlasach eadar-dhealaichte.Shoirbhich le bileagan 15N a’ falach a’ phròtaineome boireann, ged a b’ urrainnear beagan de phròtain gun bileagan a lorg bho na maighdeanan le bileagan.Chlàr sinn lorg lughdachadh pròtain fireann (speactra 1-5) ann an sampallan amh boireann a-mhàin ann an ruith theicnigeach, far an deach sampallan amh a ruith às deidh sampallan fireann/pòsaidh, mar thoradh air “giùlan thairis” HPLC.Tha pròtainean corra uair a lorgar mar ‘thruailleadh’ bho mhaighdeanan le bileagan air an liostadh ann an Clàr Taiceil 1.
Dà pheiptid antigenach, QTTDRVAPAPDQQQ (taobh a-staigh isotype PA) agus MESDGTTPSGDSEQ (taobh a-staigh isotype PA agus PB) ann an Genscript. Chaidh an dà pheiptid a chur còmhla, an uairsin an ceangal ris a’ phròtain giùlain KLH agus an stealladh a-steach do choineanaich Sealan Nuadh. Chaidh na coineanaich a ìobairt às deidh a’ cheathramh stealladh, agus chaidh IgG iomlan a sgaradh le glanadh dlùth-chàirdeas. Chaidh IgG bhon choineanach as sònraichte do EPP a chleachdadh airson tuilleadh blotting an iar.
Airson blotaichean an iar, chaidh MAG (n = 10, far a bheil n a’ riochdachadh an àireamh de shamhlaichean mosgìoto neo-eisimeileach gu bith-eòlasach) agus LRT boireann (n = 30) bho fhireannaich òigh 4 latha a dh'aois agus boireannaich òigh no boireannaich air an èigneachadh (<10 às dèidh suirghe), bufair às-tharraing pròtain (50 mM Tris, pH 8.0; 1% NP-40; 0.25% sodium deoxycholate; 150 mM NaCl; 1 mM EDTA; measgachadh casg protease 1 × (Roche)) a chur ris air leth. Chaidh na sampallan a dhèanamh co-chothromach dìreach às dèidh an sgaradh le beader (grìogagan glainne 2 mm, 2,400 rpm, 90 diog). Chaidh sprùilleach neo-sholabailte a thoirt air falbh le centrifugation aig 20,000 g aig 4 °C. Chaidh pròtainean a thomhas le deuchainn Bradford (Bio-Rad). An uairsin, chaidh 20 µg de phròtain MAG, 40 µg de phròtain LRT, agus 20 µg de phròtain mòr a bha air fhàgail a dhì-nàdarrachadh agus a sgaradh le 10% Bis-Tris NuPAGE a’ cleachdadh bufair MOPS. Chaidh pròtainean a ghluasad gu membranan polyvinylidene fluoride a’ cleachdadh siostam gluasaid iBlot2 (Thermo Fisher). Chaidh na membranan a nighe dà uair ann an 1 × PBS-T (0.1% Tween-20 ann am PBS) agus an uairsin chaidh am bacadh ann am bufair bacadh Odyssey (Li-Cor) airson 1 uair aig 22 ° C. Chaidh na membranan a chrathadh thar oidhche aig 4 ° C le antibody polyclonal coineanach gnàthaichte an-aghaidh EPP (1:700 ann am bufair bacadh) agus antibody monoclonal radain an-aghaidh actin MAC237 (Abeam; 1:4,000). Chaidh na membranan a nighe le PBS-T agus an uairsin chaidh an goir le antibodies àrd-sgoile (asal an-aghaidh coineanach 800CW agus gobhar an-aghaidh radain 680LT (Li-Cor), an dà chuid 1:20,000) ann am bufair bacadh anns a bheil 0.01% SDS agus 0.2% Tween -20 airson 1 uair aig 22 °C. Chaidh na membranan a nighe le PBS-T agus chaidh an dealbh a thogail le sganair Odyssey CLx. Chaidh na h-ìomhaighean a chruinneachadh agus a phròiseasadh ann an Image Studio (dreach 5.2). Cha deach còmhlan sònraichte a bha a’ freagairt ris an isoform EPP-RA (82 kDa) a lorg.
Chaidh na roinnean còdaidh de EPP (mar isoform AGAP002463-RB anns a bheil àrainn histidine phosphatase, NCBI conserved domain search 34) agus EcK2 (AGAP002181) a chlònadh a-steach do phlasmaid pET-21a(+) (Novagen Millipore Sigma); Tha na prìomhairean air an liostadh ann an Clàr Dàta Leudaichte 2. Chaidh ochd ceanglaichean GS4 (ann an tandem) a chuir a-steach ron tag 6xHis C-terminal den togail pET-21a(+)-EcK2. Chaidh pròtainean ath-chuingealaichte a thoirt gu buil a’ cleachdadh ath-bhualadh co-chur pròtain E. coli gun cheallan NEBExpress (New England BioLabs). Chaidh pròtainean ath-chuingealaichte a ghlanadh a’ cleachdadh colbhan snìomh NEBExpress Ni (New England BioLabs). Chaidh pròtain smachd dihydrofolate reductase (DHFR) a thoirt gu buil a’ cleachdadh teamplaid DNA bhon Pasgan Co-chur Pròtain E. coli gun Cheallan NEBExpress. Chaidh pròtainean a stòradh ann an 50% glycerol ann am PBS aig -20 °C airson suas ri 3 mìosan.
Chaidh gnìomhachd fosfatase EPP agus earrannan clò a thomhas le bhith a’ cleachdadh 4-nitrophenyl phosphate (pNPP; Sigma-Aldrich). Bha 25 mM Tris, 50 mM searbhag aiseatach, 25 mM Bis-Tris, 150 mM NaCl, 0.1 mM EDTA, agus 1 mM DTT anns a’ bhufair ath-bhualaidh. Chaidh clò a dhèanamh co-chothromach ann am bufair ath-bhualaidh agus chaidh sprùilleach cealla a thoirt air falbh le bhith ga shnìomh-chriathradh. Tòisich an ath-bhualadh le bhith a’ cur enzyme no earrann clò ri bufair ath-bhualaidh anns a bheil 2.5 mg ml-1 pNPP. Chaidh am measgachadh ath-bhualaidh a ghoir aig teòthachd an t-seòmair anns an dorchadas, agus chaidh meud pNP a chaidh a thionndadh bho pNPP a thomhas le bhith a’ tomhas an absorbance aig 405 nm aig diofar amannan.
Airson gnìomhachd EcK in vitro, chaidh am pròtain a ghoir le 0.2 mg 20E no 3D20E ann am bufair 200 µl (pH 7.5) anns an robh 10 mM HEPES–NaOH, 0.1% BSA, 2 mM ATP agus 10 mM MgCl2 airson 2 uair aig 27 °C. Chaidh an ath-bhualadh a stad le bhith a’ cur 800 µl methanol ris, an uairsin chaidh a fhuarachadh aig -20 °C airson 1 uair, agus an uairsin chaidh a chuir ann an centrifuge aig 20,000 g airson 10 mionaidean aig 4 °C. Chaidh an t-supernatant an uairsin a sgrùdadh le HPLC-MS/MS. Gus na pròtainean a chaidh a chleachdadh sa bhuidheann smachd a dhì-ghnìomhachadh le teas, chaidh na pròtainean a ghoir ann an 50% glycerol ann am PBS airson 20 mionaid aig 95 °C.
Airson gnìomhachd EPP in vitro, chaidh am pròtain a ghoir le 3D20E22P (co-ionann ris an ìre a lorgar ann an 18 paidhir de MAG, air an glanadh le HPLC-MS/MS) ann an 100 µl bufair (pH 7.5) anns an robh 25 mM Tris, 50 mM searbhag aiseatach, 25 mM Bis-Tris, 150 mM NaCl, 0.1 mM EDTA, agus 1 mM DTT airson 3 uairean a thìde aig 27 °C. Chaidh an ath-bhualadh a stad le bhith a’ cur 400 µl methanol ris agus chaidh fhuarachadh aig -20 °C airson 1 uair a thìde, agus an uairsin a chuir ann an centrifuge aig 20,000 g airson 10 mionaidean aig 4 °C. Chaidh an t-supernatant a sgrùdadh le HPLC-MS/MS.
Chaidh criomagan PCR airson EPP (362 bp), EcK1 (AGAP004574, 365 bp) agus EcK2 (556 bp) a mheudachadh bho cDNA a chaidh ullachadh bho chorp mosgìoto measgaichte gun cheann. Chaidh criomag PCR an smachd eGFP (495 bp) a mheudachadh bhon pCR2.1-eGFP a chaidh a mhìneachadh roimhe; Tha prìomhairean PCR air an liostadh ann an Clàr Dàta Leudaichte 2. Chaidh am pìos PCR a chuir a-steach eadar na luchd-adhartachaidh T7 air an tionndadh air a’ phlasmaid pL4440. Chaidh togail plasmid fhaighinn air ais bho E. coli comasach NEB 5-α (New England Biolabs) agus chaidh an dearbhadh le sreath DNA mus deach an cleachdadh (faic Dàta Taiceil 1 airson sreath cuir a-steach). Chaidh prìomhairean a bha co-ionnan ris an neach-adhartachaidh T7 (Clàr Dàta Leudaichte 2) a chleachdadh gus an cuir a-steach a leudachadh bhon phlasmaid stèidhichte air pL4440. Chaidh meud toraidh PCR a dhearbhadh le electrophoresis gel agarose. Chaidh dsRNA a thar-sgrìobhadh bho theamplaidean PCR a’ cleachdadh an Megascript T7 Transcription Kit (Thermo Fisher) agus chaidh a ghlanadh a rèir stiùiridhean an neach-dèanamh leis na h-atharrachaidhean a chaidh a mhìneachadh roimhe.
Airson stealladh dsRNA, chaidh 1,380 ng de dsRNA (dsGFP, dsEcK1, dsEcK2, dsEPP) a stealladh aig dùmhlachd de 10 ng nl-1 a-steach do thorax fhireannaich no bhoireannaich inbheach (Nanoject III, Drummond) taobh a-staigh 1 latha às deidh eclosure. Chaidh ìrean cnag-sìos gine a dhearbhadh ann an co-dhiù trì leth-bhreacan bith-eòlasach le às-tharraing RNA, co-chur cDNA, agus RT-qPCR. Airson stealladh ecdysone, chaidh boireannaich òigh 4 latha a dh'aois no 6 latha a dh'aois air am biathadh le fuil a stealladh le 0.13, 0.21, no 0.63 µg de 20E no 3D20E (Nanoject III, Drummond) aig dùmhlachdan de 1.3, 2.1, fa leth, a rèir dealbhadh an deuchainn no 6.3 ng nl-1. Cuir stealladh a-steach 100 nl de ethanol 10% (vol/vol) ann an uisge; 100 nl de 3D20E22P ann an 10% ethanol (co-ionann ri 75% den mheud a lorgar ann am paidhir de MAGan). Chaidh mosgìotothan a shònrachadh air thuaiream don bhuidheann stealladh.
Airson deuchainnean sìolachaidh, chaidh boireannaich 3 latha a dh'aois a bhiadhadh ad libitum le fuil dhaoine. Thoir air falbh mosgìotothan a chaidh a bhiadhadh gu ìre no nach deach a bhiadhadh. A rèir an làimhseachaidh, chaidh boireannaich a chur ann an cupannan sìolachaidh fa leth airson ceithir oidhcheannan co-dhiù 48 uairean an dèidh biadh na fala. Chaidh uighean a chunntadh fo stereoscop (Stemi 508, Zeiss); airson boireannaich a chaidh a phòsadh, chaidh uighean a rugadh gu bhith nan larbha a mheas torrach.
Airson deuchainnean suirghe, fhuair boireannaich co-dhiù 2 latha a rèir an làimhseachaidh gus strì an aghaidh suirghe a leasachadh, agus chaidh fireannaich fiadhaich den aon aois a thoirt a-steach don chèidse cheudna às dèidh sin. Dà oidhche an dèidh sin, chaidh na vesicles boireann a chaidh a thorrachadh a sgaradh agus chaidh DNA genomic a leigeil ma sgaoil le reothadh-leaghadh agus sonication ann am bufair anns an robh 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, agus 25 mM NaCl (pH 8.2). Chaidh sampallan a ghoir le Proteinase K (0.86 µg µl-1) airson 15 mionaidean aig 55 °C, agus an uairsin 10 mionaidean aig 95 °C. Chaidh ullachaidhean DNA genomic amh a lagachadh 10-fhillte agus chaidh an cur fo lorg qPCR de shreathan cromosome Y; tha prìomhairean air an liostadh ann an Clàr Dàta Leudaichte 2. Tha dìth sreath cromosome Y a’ comharrachadh nach eil suirghe ann.
Airson deuchainnean ath-chàraideachaidh, chaidh sgrùdadh a dhèanamh air boireannaich a chaidh a phòsadh fo èiginn airson plugaichean càraideachaidh gus dearbhadh gu robh an suidheachadh càraideachaidh aca agus leig iad leotha 2 latha a ghabhail gus ath-sheasmhachd a leasachadh ri càraideachadh às aonais fhireannaich, mar a chaidh a mhìneachadh roimhe 36. Chaidh fireannaich a bha a’ giùlan sperm tar-ghinealach DsRed an uairsin a thoirt a-steach do chèidsean boireann. Dà oidhche às deidh sin, chaidh na vesicles torrachaidh a sgaradh bho na boireannaich, agus chaidh DNA genomic ullachadh mar a chaidh a mhìneachadh gu h-àrd agus a chur fo lorg qPCR den transgene DsRed; tha na prìomhairean air an liostadh ann an Clàr Dàta Leudaichte 2. Chomharraich neo-làthaireachd an transgene DsRed nach do thachair ath-chàraideachadh.
Chaidh 3D20E a cho-chur mar a chaidh a mhìneachadh roimhe 37. Gu h-aithghearr, chaidh 10 mg de 20E (Sigma-Aldrich) a sgaoileadh ann an 10 ml de dh’uisge, agus an uairsin chaidh 30 mg de dhubh platanam (ann an cruth pùdar, Sigma-Aldrich) a chur ris. Chaidh sruth socair de O2 a thoirt a-steach don mheasgachadh ath-bhualadh gu leantainneach, a chaidh a mheasgachadh aig teòthachd an t-seòmair. Às deidh 6 uairean a thìde, chaidh 30 mL de methanol a chur ris gus stad a chuir air an ath-bhualadh. Chaidh am measgachadh a chuir ann an centrifuge gus mìrean catalyst a thoirt air falbh. Chaidh an t-supernatant a ghalachadh gu tioram ann am falamh aig teòthachd an t-seòmair. Chaidh an toradh ath-bhualadh tioram a sgaoileadh ann an 10% ethanol agus methanol airson stealladh airson mion-sgrùdadh HPLC-MS / MS. Bha an ìre tionndaidh (bho 20E gu 3D20E) timcheall air 97% (Figear 4b), agus bha speactram MS an 3D20E a chaidh a cho-chur a rèir an fheadhainn a lorgar ann am boireannaich a chaidh a phòsadh (Figear 4c).
Tha mion-fhiosrachadh sònraichte anns an uirsgeul mu na deuchainnean staitistigeil a chaidh a dhèanamh. Chaidh GraphPad (dreach 9.0) a chleachdadh gus deuchainn Fisher, deuchainn Mantel-Cox, agus deuchainn-t an Oileanaich a dhèanamh. Chaidh deuchainnean Cochran-Mantel-Haenszel a dhèanamh a’ cleachdadh sgriobt R gnàthaichte (ri fhaighinn aig https://github.com/duopeng/mantelhaen.test). Chaidh an sgaoileadh dàta a dhearbhadh airson àbhaisteachd a’ cleachdadh deuchainn Shapiro-Wilk le stairsneach cudromachd de 0.05. Nuair a dh’fhàillig an dàta an deuchainn àbhaisteachd, chaidh deuchainn Mann-Whitney a dhèanamh. Chaidh dàta mairsinn beò a sgrùdadh a’ cleachdadh deuchainn Mantel-Cox. Chaidh am pasgan DESeq2 (dreach 1.28.1) a chleachdadh gus mion-sgrùdadh eadar-dhealaichte air abairt ìre gine RNA-seq a dhèanamh. Tha am bàr còmhnard air a’ ghraf a’ riochdachadh a’ mheadhain. Chaidh luach cudromachd de P = 0.05 a chleachdadh mar an stairsneach airson a h-uile deuchainn.
Airson tuilleadh fiosrachaidh mu dhealbhadh an sgrùdaidh, faic geàrr-chunntas Aithisg Rannsachaidh Nàdair a tha ceangailte ris an artaigil seo.
Chaidh dàta proteomic MS a thasgadh ann an Consortium ProteomeXchange (http://proteomecentral.proteomexchange.org) tron ​​PRIDE Partner Repository (https://www.ebi.ac.uk/pride/) leis an aithnichear seata dàta PXD032157.
Tha an seata dàta RNA-seq air a thasgadh ann an Leabharlann Choileanta Gene Expression (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) fon chlàr sreathach GSE198665.
Gheibhear seataichean dàta a bharrachd a chaidh a chruthachadh agus/no a sgrùdadh rè an sgrùdaidh seo bho na h-ùghdaran co-fhreagarrach ma thèid iarraidh orra gu reusanta. Tha an t-artaigil seo a’ toirt seachad an dàta tùsail.
De Loof, A. Ecdysteroids: Steroidan gnè bhiastagan air an dearmad? Fireann: Bogsa Dubh. Saidheans nam Biastagan. 13, 325–338 (2006).
Redfern, CPF 20-hydroxyecdysone agus leasachadh ubhagach ann an Anopheles stephens. J. Insect Physiology. 28, 97–109 (1982).