Tha seòrsachadh phròtainean anns an t-slighe dìomhair riatanach airson roinneadh cheallan agus homeostasis a chumail suas. A bharrachd air seòrsachadh tro shligean, tha àite lipids ann an seòrsachadh kinesin ann am pròiseas còmhdhail dìomhair na cheist bhunasach a tha air a bhith ann o chionn fhada nach deach freagairt fhathast. An seo, bidh sinn a’ dèanamh ìomhaighean fìor-ùine àrd-rùn ioma-dath 3D aig an aon àm gus dearbhadh in vivo gu bheil pròtainean ùra glycosylphosphatidylinositol neo-ghluasadach le moieties lipid ceramide glè fhada air an cruinneachadh agus air an seòrsachadh ann an làrach fàgail lom endoplasms sònraichte, a tha eadar-dhealaichte bhon fhear a bhios pròtainean transmembrane a’ cleachdadh. A bharrachd air an sin, tha sinn a’ sealltainn gu bheil fad slabhraidh ceramide ann am membran an reiticil endoplasmic deatamach airson an roghnachd seòrsachaidh seo. Tha an sgrùdadh againn a’ toirt seachad a’ chiad fhianais dhìreach in vivo gus luchdan pròtain a sheòrsachadh stèidhichte air fad slabhraidh lipid ann an làraichean às-mhalairt roghnach anns an t-slighe dìomhair.
Ann an ceallan eukaryotic, bidh na pròtainean a chaidh a cho-chur anns an reiticeal endoplasmic (ER) an uairsin air an seòrsachadh rè còmhdhail tron ​​t-slighe dìomhair airson an lìbhrigeadh chun cheann-uidhe ceallach iomchaidh aca (1). A bharrachd air seòrsachadh le còta, bha beachd ann o chionn fhada gum faod lipidean sònraichte a bhith nan puingean fàgail roghnach le bhith gan cruinneachadh ann an raointean membran sònraichte a bhios a’ comharrachadh pròtainean sònraichte (2-5). Ach, chan eil fianais dhìreach in vivo ann fhathast gus an dòigh-obrach seo stèidhichte air lipid a dhearbhadh. Gus an duilgheadas bunaiteach seo fhuasgladh, rinn sinn sgrùdadh ann an giosta mar a thèid pròtainean acair glycosylphosphatidylinositol (GPI) (GPI-APs) a thoirt a-mach às an ER ann an dòigh eadar-dhealaichte. Tha GPI-APs nan measgachadh de phròtainean uachdar cealla ceangailte ri lipid (6, 7). Tha GPI-AP na phròtain dìomhair ceangailte ri duilleagan a-muigh membran plasma tron ​​​​​​mhoiety glycolipid (acair GPI). Bidh iad a’ gabhail ri acair GPI mar atharrachaidhean iar-eadar-theangachaidh glèidhteachail ann an lumen an ER (8). Às dèidh a cheangal, bidh GPI-AP a’ dol tron ​​inneal Golgi (5, 9) bhon ER chun a’ phlasma membrane. Tha làthaireachd acairean GPI ag adhbhrachadh gum bi GPI-AP air a ghiùlan air leth bho phròtainean a tha air an dìomhaireachd thar-membrane (a’ gabhail a-steach pròtainean membrane plasma eile) air an t-slighe dìomhaireachd (5, 9, 10). Ann an ceallan beirm, tha GPI-APan air an sgaradh bho phròtainean eile a tha air an dìomhaireachd anns an reticulum endoplasmic, agus an uairsin air am pacadh ann am vesicles sònraichte air am pasgadh le co-thàthadh pròtain còta II (COPII) (6, 7). Chan eil na nithean a tha a’ dearbhadh a’ phròiseis seòrsachaidh seo ann am pròiseas às-mhalairt ER soilleir, ach thathas a’ beachdachadh gum faodadh an dòigh-obrach seo lipids a dhìth, gu sònraichte ath-dhealbhadh structarail pàirt lipid acair GPI (5, 8). Ann am beirm, bidh ath-dhealbhadh lipid GPI a’ tòiseachadh dìreach às deidh don GPI ceangal, agus ann am mòran chùisean, bidh e ag adhbhrachadh gum bi ceramide a’ ceangal ris an searbhag geir shàthaichte slabhraidh fhada 26-carbon (C26:0) (11, 12). ’S e ceramide C26 am prìomh ceramide a bhios ceallan beirm a’ dèanamh gu ruige seo. Tha e air a cho-chur san ER agus tha a’ mhòr-chuid dheth air a thoirt a-mach chun inneal Golgi tro vesicles COPII (13). Tha às-mhalairt GPI-AP san ER gu sònraichte ag iarraidh co-chur ceramide leantainneach (14, 15), agus an uair sin, tha tionndadh ceramide gu ceramide fosfáit inositol (IPC) san inneal Golgi an urra ri co-chur acair GPI (16). Tha sgrùdaidhean bith-fiosaigeach le membranan fuadain air sealltainn gum faod ceramides slabhraidh acyl glè fhada tighinn còmhla gus raointean òrdaichte a chruthachadh le feartan corporra sònraichte (17, 18). Tha an dàta seo a’ leantainn chun a’ bheachd-bharail gu bheil ceramide C26 agus GPI-AP le ceramide C26 a’ cleachdadh an cuid feartan corporra gus tighinn còmhla ann an roinnean no roinnean òrdail ann an àrainneachd lipid membran ER a tha caran meallta. Tha e air a dhèanamh suas sa mhòr-chuid de glycerolipids goirid agus neo-shàthaichte (C16:1 agus C18:1) (19, 20). Bidh na roinnean seo air an cuimseachadh gu roghnach air làraichean fàgail sònraichte ER (ERES), far am faodar ceramide agus GPI-AP stèidhichte air ceramide a ghiùlan còmhla chun Golgi san aon vesicle COPII sònraichte (5).
Anns an sgrùdadh seo, rinn sinn deuchainn dhìreach air a’ mheacanaig seo stèidhichte air lipid le bhith a’ cleachdadh microscopaidh ìomhaighean fìor-ùine confocal super-rùn (SCLIM), a tha na dhòigh-obrach microscopaidh ùr-nodha as urrainn pròtainean le bileagan fluorescent fhaicinn aig an aon àm. Tha rùn agus astar air leth àrd aig na h-ìomhaighean trì-dathte agus trì-thaobhach (3D) ann an ceallan beò (21, 22).
An toiseach, chuir sinn teicneòlas SCLIM an sàs gus mìneachadh nas mionaidiche mar a chaidh GPI-AP àbhaisteach le buidheann ceramide C26 a sgrìonadh bho phròtainean a chaidh a leigeil ma sgaoil thar-membran às deidh dhaibh an ER fhàgail ann an S. cerevisiae. Gus seòrsachadh ER a dhearbhadh, chleachd sinn siostam ginteil as urrainn bathar ùr-shintéiseach a’ dol a-steach do ERES fhaicinn gu dìreach in vivo (7, 23). Mar bathar, thagh sinn GPI-AP Gas1 stèidhichte air ceramide C26 air a chomharrachadh le pròtain fluorescent uaine (GFP) agus pròtain Mid2 air a leigeil ma sgaoil thar-membran air a chomharrachadh le pròtain fluorescent faisg air infridhearg (iRFP), agus tha an dà chuid ag amas air a’ membran plasma (24–26). Anns a’ mhutant mothachail air teòthachd sec31-1, tha an dà chargo seo air an cur an cèill fo bhrosnaichear galactose-inducible agus comharra ERES bun-reachdail. Aig an teòthachd anabarrach (37°C), leis gu bheil am mùthadh sec31-1 a’ toirt buaidh air gnìomh pàirt còta COPII Sec31 gus casg a chuir air ginideachadh COPII agus às-mhalairt ER, bidh bathar ùr-shintéiseach a’ cruinneachadh aig an ER (23). Às dèidh fuarachadh gu teòthachd ìosal (24°C), fhuair na ceallan mutant sec31-1 seachad air an raon dìomhair, agus thòisich an luchd synthetigeach ùr cruinnichte air a thoirt a-mach às an ER. Sheall lèirsinn CLIM gun robh a’ mhòr-chuid den Gas1-GFP agus Mid2-iRFP a chaidh a cho-chur às ùr fhathast air cruinneachadh ann an ER nan ceallan mutant sec31-1 às dèidh goinneadaireachd aig 37°C agus an uairsin air an leigeil ma sgaoil aig 24°C airson 5 mionaidean (Figear 1). Leis gu bheil Mid2-iRFP air a sgaoileadh air feadh membran an ER, agus gu bheil Gas1-GFP dùmhail agus air a chruinneachadh ann an raon membran neo-leantainneach an ER, tha an sgaoileadh gu tur eadar-dhealaichte (Figear 1, A gu C agus Film S1). A bharrachd air an sin, mar a chithear ann am Figear 1D, chan eil Mid2-iRFP aig a’ chruinneachadh Gas1-GFP. Tha na toraidhean seo a’ nochdadh gun deach GPI-AP agus pròtainean thar-membran a sgaradh gu diofar roinnean membran ER tràth. Tha an cruinneachadh Gas1-GFP ri taobh ERES sònraichte air a chomharrachadh le pròtain còta COPII mCherry Sec13 (Figear 1, E agus F, agus film S1) (23).
Bidh ceallan sec31-1 a’ cur an cèill dìomhaireachdan air an adhbhrachadh le galactose, ceramide slabhraidh fhada acyl (C26) GPI-AP Gas1-GFP (GPI-AP, uaine) agus am pròtain thar-membran Mid2-iRFP (TMP, gorm) agus chaidh an leubail togail ERES seo Sec13-mCherry (ERES, magenta) a ghoir aig 37°C airson 30 mionaid, a ghluasad gu 24°C, agus a dhealbhadh le SCLIM 5 mionaidean às deidh sin. (A gu C) a’ sealltainn ìomhaigh riochdachail aon-fhillte no aon-fhillte 2D de phlèana (A), ìomhaigh ro-mheasaidh 2D de 10 earrannan-z (B) no ìomhaigh leth-chruinne cealla 3D de luchd agus comharran ERES (C). Bàr sgèile 1μm (A agus B). Is e an aonad sgèile 0.551μm (C). Chaidh Gas1-GFP a lorg ann an roinnean no cruinneachaidhean ER fa leth, agus chaidh Mid2-iRFP a lorg agus a sgaoileadh air feadh membran ER (C). (D) Tha a’ ghraf a’ sealltainn dian fluorescence coimeasach Gas1-GFP agus Mid2-iRFP anns a’ chruinneachadh Gas1-GFP air loidhne na saighead geal (clì). AU, aonad neo-riaghailteach. Tha (E agus F) a’ riochdachadh an ìomhaigh 3D a tha a’ cothlamadh a’ bhathair agus comharra ERES. Chaidh cruinneachaidhean Gas1-GFP a lorg faisg air an ERES sònraichte. Is e 0.551μm an aonad sgèile. (F) Tha an t-saighead gheal sholadach a’ comharrachadh a’ chruinneachadh Gas1-GFP co-cheangailte ri ERES. Tha na pannalan meadhanach is deas a’ sealltainn an ìomhaigh 3D leudaichte co-mheasgaichte agus sealladh rothlach den chruinneachadh Gas1-GFP taghte.
Tha an dàimh dlùth spàsail eadar cruinneachadh Gas1-GFP agus ERES sònraichte a’ nochdadh gum faod Gas1-GFP a dhol a-steach do ERES roghnach, a tha eadar-dhealaichte bhon roghnachd a bhios Mid2-iRFP a’ cleachdadh gus an ER fhàgail. Gus dèiligeadh ris a’ chomas seo, thomhais sinn co-mheas ERES airson dìreach aon no dhà bhathar (Figear 2, A gu C). Fhuair sinn a-mach nach eil ach aon seòrsa bathar anns a’ mhòr-chuid de ERES (70%). Tha an ìomhaigh aig bonn Figear 2C a’ sealltainn dà eisimpleir àbhaisteach de ERES le dìreach Gas1-GFP (Figear 1) no dìreach Mid2-iRFP (Figear 2). An coimeas ri sin, tha timcheall air 20% de ERES a’ toirt a-steach dà bhathar a tha a’ dol thairis air a chèile san aon raon. Chaidh a lorg gu robh dà sheòrsa bathar ann an cuid de ERES (10%), ach bha iad air an sgaradh ann an raointean gu soilleir eadar-dhealaichte. Mar sin, tha an anailis staitistigeil seo a’ sealltainn, às deidh an ER a bhith air a thoirt a-mach, gu bheil GPI-AP Gas1-GFP agus am bathar thar-membrane Mid2-iRFP air an roinn ann an diofar ERES (Figear 2D). Tha an èifeachdas seòrsachaidh seo glè choltach ris an anailis bith-cheimiceach roimhe (6) agus an dearbhadh morf-eòlach (7). Is urrainn dhuinn cuideachd giùlan a’ chargu cuarantain a’ dol a-steach do ERES fhaicinn (Figear 2E agus Film S2). Tha Figear 2E a’ sealltainn nach eil ach pàirt bheag de Gas1-GFP (pannal 3) no Mid2-iRFP (pannal 4) a’ dol a-steach don ERES bho aon taobh agus gu bheil e air a chuingealachadh ann an raon fa leth. Tha Pannal 5 de Fhigear 2E a’ sealltainn gu bheil Gas1-GFP agus Mid2-iRFP uaireannan rim faighinn san aon ERES, ach bidh iad a’ dol a-steach bho dhiofar thaobhan agus tha iad dùmhail ann an roinnean fa leth a dh’ fhaodadh a bhith a’ riochdachadh diofar vesicles COPII. Dhearbh sinn cuideachd gu bheil an dealachadh agus an seòrsachadh a chaidh fhaicinn de GPI-AP Gas1 stèidhichte air ceramide C26 mar ERES roghnach sònraichte leis gu bheil cargo dìomhaireachd thar-membran eile, am pròtain membran plasma le tagaichean GFP Axl2 (27), a’ sealltainn giùlan coltach ri Mid2-iRFP. (Dealbh S1 agus Film S3). Tha an Axl2-GFP ùr-shintéisichte air a sgaoileadh tron ​​membran ER mar Mid2-iRFP (Figear S1, A agus B), agus tha e co-ionadailichte le Mid2-iRFP anns a’ mhòr-chuid de ERES (Figear S1, B gu D). Tha Pannalan 1 agus 2 de Fhigear 1. Tha S1C a’ sealltainn dà eisimpleir àbhaisteach de ERES far a bheil dà luchd thar-membran a’ dol thairis air a chèile. Anns na cùisean sin, bidh an dà bhathar a’ dol a-steach do ERES còmhla (Figear S1E, Pannal 3 agus Film S3).
Chaidh na ceallan sec31-1 a bha a’ cur an cèill dìomhaireachdan a ghabhas brosnachadh le galactose, Gas1-GFP (GPI-AP, uaine) agus Mid2-iRFP (TMP, gorm) agus bileagan bun-reachdail ERES Sec13-mCherry (ERES, magenta) a chur aig 37. Às dèidh dhaibh a bhith air an goir airson 30 mionaid aig °C, gluais gu 24 °C gus am bloc dìomhaireachd a leigeil ma sgaoil, agus dèan dealbh le SCLIM às dèidh 20 mionaid. (A gu C) Ìomhaighean ro-mheasaidh 2D riochdachail (A; bàr sgèile, 1μm) no ìomhaighean leth-chruinne cealla 3D (B agus C; aonad sgèile, 0.456μm) den luchd agus 10 earrannan-z air an comharrachadh le ERES. Tha am pannal ìosal ann an (B) agus am pannal ann an (C) a’ taisbeanadh ìomhaighean giullaichte gus dìreach am bathar a tha an làthair ann an ERES (magenta) [Gas1-GFP (liath) agus Mid2-iRFP (gorm aotrom)] a thaisbeanadh. (C) Saighead fhosgailte: Chan eil ERES a’ giùlan ach aon phìos de luchd (1 gu 4). Saighead liath: Tha ERES anns a bheil bathar air a sgaradh (5). Saighead gheal, sholadach: ERES anns a bheil bathar co-shuidhichte. Gu h-ìosal: Chan eil anns an ERES singilte taghte ach Gas1-GFP (1) no Mid2-iRFP (2). Bàr-sgèile, 100 nm. (D) Meudachadh an dealbh-mhicrograf a tha air a mhìneachadh ann an (C). An ceudad cuibheasach de ERES anns nach eil ach aon bathar (Gas1-GFP no Mid2-iRFP), bathar air a sgaradh agus bathar a tha a’ dol thairis air a chèile. Ann an trì deuchainnean neo-eisimeileach, n = 432 ann an 54 ceallan. Bàr-mearachd = SD. Deuchainn-t dà-earballach gun chàradh. *** P = 0.0002. (E) Ìomhaigh 3D de ERES taghte de bhathar cuarantain air a chomharrachadh le (C). Bidh Gas1-GFP (uaine) (3) no Mid2-iRFP (gorm) (4) a’ dol a-steach do ERES (magenta) bho aon taobh agus tha e air a chuingealachadh ri raon beag taobh a-staigh ERES. Aig amannan, bidh an dà sheòrsa bathar a’ dol a-steach don aon ERES (5) bhon aon taobh agus tha iad air an cuingealachadh ri raon iomallach taobh a-staigh an ERES. Bàr-sgèile, 100 nm.
An ath rud, rinn sinn deuchainn air barail gur e an ceramide slabhraidh fhada acyl (C26) a tha an làthair anns a’ membran ER a bhios a’ stiùireadh cruinneachadh is seòrsachadh sònraichte Gas1 gu ERES roghnach. Gus seo a dhèanamh, chleachd sinn sreath beirm atharraichte GhLag1, anns an deach an dà synthase ceramide endogenous Lag1 agus Lac1 a chur an àite GhLag1 (an homolog Lag1 de cotan), agus mar thoradh air sin bha sreath beirm le sreath Ceramide nas giorra na an seòrsa fiadhaich (Figear 3A) (28). Sheall mion-sgrùdadh speactramaitreachd mais (MS) ann an sreathan fiadhaich, gu bheil 95% den ceramide iomlan na ceramide slabhraidh glè fhada (C26), agus ann an GhLag1, gu bheil 85% den ceramide glè fhada (C18 agus C16), chan eil ach 2% de ceramide na ceramide slabhraidh glè fhada (C26). Ged is iad ceramides C18 agus C16 na prìomh ceramides a chaidh a lorg ann am membran GhLag1 gu ruige seo, dhearbh mion-sgrùdadh MS cuideachd gu bheil ceramide C26 anns an acair GPI de Gas1-GFP a chaidh a chur an cèill anns a’ ghnè GhLag1, a tha co-chosmhail ri lipids fiadhaich. Tha an càileachd mar an ceudna (Figear 3A) (26). Mar sin, tha seo a’ ciallachadh gu bheil an einnsein ath-dhealbhachaidh ceramide Cwh43 gu math roghnach airson ceramide C26, mar a chithear ann am Figear 26, tha e a’ toirt a-steach an acair GPI bho mheud bheag de ceramide C26 anns a’ ghnè GhLag1. S2 (29). A dh’aindeoin sin, chan eil ann am membran cealla GhLag1 ach ceramide C18-C16, agus tha ceramide C26 fhathast aig Gas1-GFP. Tha an fhìrinn seo a’ dèanamh an t-sròin seo na inneal air leth freagarrach airson fuasgladh sònraichte fhaighinn air duilgheadas fad slabhraidh acyl ceramide membran anns an ER. Dreuchd mac-meanmnach clas agus seòrsachadh. An uairsin, rinn sinn sgrùdadh an toiseach air comas C26 Gas1-GFP cruinneachadh ann an cruinneachaidhean ann an GhLag1 le allele mutant mothachail air teòthachd de sec31-1 tro mhicreasgopaidh fluorescence àbhaisteach, far nach eil ach an t-sreath fhada (C18-C16) ann am membran ER Ceramide (Figear 3). Chunnaic sinn, ann an sec31-1, gu robh a’ mhòr-chuid de Gas1-GFP dùmhail ann an cruinneachaidhean, agus nach robh Gas1-GFP ann an sec31-1 GhLag1 le membran ER ceramide fada (C18-C16) air a chruinneachadh agus air a sgaoileadh sa mhòr-chuid anns a’ membran ER gu lèir. Gus a bhith mionaideach, leis gu bheil cruinneachadh stèidhichte air ceramide C26 dlùth-cheangailte ri ERES sònraichte (Figear 1), rinn sinn sgrùdadh an uairsin an gabhadh gnìomh meacanachd pròtain às-mhalairt ER a thoirt a-steach don phròiseas seo cuideachd. Bidh GPI-AP a’ cleachdadh siostam COPII sònraichte airson às-mhalairt ER, a tha air a riaghladh gu gnìomhach le ath-dhealbhadh structarail Ted1 air pàirt glycan an acair GPI (30, 31). Tha an GPI-glycan ath-chuingealaichte an uair sin air aithneachadh leis an iom-fhillte p24 gabhadair bathair thar-membrane, a bhios an uair sin a’ fastadh Lst1 gu roghnach, isoform sònraichte den phrìomh fho-aonad ceangail bathair COPII Sec24, a’ cruthachadh COPII beairteach ann an GPI-AP. Tha feum air vesicles (31-33). Mar sin, thog sinn mutant dùbailte a chuir còmhla cuir às do na pròtainean singilte seo (am pàirt iom-fhillte p24 Emp24, einnsein ath-dhealbhachaidh GPI-glycan Ted1 agus an fho-aonad COPII sònraichte Lst1) leis a’ ghnè mutant sec31-1, agus rinn sinn sgrùdadh orra. A bheil e comasach GFP Gas1-cluster a chruthachadh (Figear 3). Chunnaic sinn ann an sec31-1emp24Δ agus sec31-1ted1Δ, gu bheil Gas1-GFP sa mhòr-chuid gun chruinneachadh agus air a sgaoileadh air feadh membran an ER, mar a chunnacas roimhe ann an sec31-1 GhLag1, agus ann an sec31-1lst1Δ, Gas1-GFP Coltach ri sec31-1. Tha na toraidhean seo a’ nochdadh, a bharrachd air làthaireachd ceramide C26 ann am membran an ER, gum feum cruinneachadh Gas1-GFP ceangal ris a’ cho-thàthadh p24 cuideachd, agus nach eil feum air fastadh Lst1 sònraichte. An uairsin, rinn sinn sgrùdadh air a’ chomas gum faod fad slabhraidh ceramide ann am membran an ER ceangal Gas1-GFP ri p24 a riaghladh. Ach, fhuair sinn a-mach nach eil làthaireachd ceramide C18-C16 anns a’ membran a’ toirt buaidh air na GPI-glycans a chaidh ath-thogail leis a’ cho-thàthadh p24 (Figearan S3 agus S4, A agus B) no ceangal ri GPI-AP agus às-mhalairt GPI-AP. comas. Fastadh fo-sheòrsa COPII Lst1 (Figear S4C). Mar sin, chan eil feum aig cruinneachadh an urra ri ceramide C26 air eadar-obrachadh pròtain le diofar dhòighean-obrach pròtain às-mhalairt ER, ach tha e a’ toirt taic do dhòigh-obrach seòrsachaidh eile air a stiùireadh le fad lipid. An uairsin, rinn sinn mion-sgrùdadh a bheil fad slabhraidh acyl ceramide ann am membran an ER cudromach airson seòrsachadh èifeachdach Gas1-GFP mar ERES roghnach. Leis gu bheil Gas1 anns a’ ghnè GhLag1 le ceramide slabhraidh ghoirid a’ fàgail an ER agus a’ dol a-steach don membran plasma (Figear S5), tha sinn a’ creidsinn ma tha an seòrsachadh air a stiùireadh le fad slabhraidh acyl a’ cheramide, gum faodar an Gas1 anns a’ ghnè GhLag1 ath-stiùireadh agus a dhol tarsainn. Bathar ERES leis an aon membran.
(A) Tha ceramides C18-C16 nas giorra ann am membran cealla GhLag1 sa mhòr-chuid, agus tha an aon C26 IPC aig acair GPI Gas1-GFP ri ceallan fiadhaich. Gu h-àrd: mion-sgrùdadh fad slabhraidh acyl de ceramide ann am membran cealla sreathan fiadhaich (Wt) agus GhLag1p le speactramaitreachd mais (MS). Tha an dàta a’ riochdachadh ceudad an ceramide iomlan. Cuibheasachd trì deuchainnean neo-eisimeileach. Bàr mearachd = SD. Deuchainn-t dà-earball gun chàradh. **** P <0.0001. Pannal ìosal: Mion-sgrùdadh MS air fad slabhraidh acyl an IPC a tha an làthair anns an acair GPI Gas1-GFP (GPI-IPC) air a chur an cèill anns na sreathan fiadhaich agus GhLag1p. Tha an dàta a’ riochdachadh ceudad an t-soidhne IPC iomlan. Cuibheasachd còig deuchainnean neo-eisimeileach. Bàr mearachd = SD. Deuchainn-t dà-earball gun chàradh. ns, gun a bhith cudromach. P = 0.9134. (B) Chaidh micreagrafan fluorescence de cheallan sec31-1, sec31-1 GhLag1, sec31-1emp24Δ, sec31-1ted1Δ agus sec31-1lst1Δ a bha a’ cur an cèill Gas1-GFP air adhbhrachadh le galactose a ghoir aig 37°C airson 30 mionaid agus an uairsin an cur sìos gu Dèan micreasgopaidh fluorescence àbhaisteach an dèidh 24°C. Saighead gheal: Cruinneachadh ER Gas1-GFP. Saighead fhosgailte: Tha Gas1-GFP gun chruinneachadh air a sgaoileadh air feadh membran ER, a’ sealltainn dath fàinne niùclasach sònraichte ER. Bàr-sgèile, 5μm. (C) Meudachadh air a’ mhicreagraf-foto a tha air a mhìneachadh ann an (B). An ceudad cuibheasach de cheallan le structar Gas1-GFP punctate. Ann an trì deuchainnean neo-eisimeileach, n≥300 cealla. Bàr-mearachd = SD. Deuchainn-t neo-phàraichte dà-earballach. **** P <0.0001.
Gus an duilgheadas seo fhuasgladh gu dìreach, rinn sinn dealbh-sgrìn SCLIM de Gas1-GFP agus Mid2-iRFP ann an GhLag1 leis an allele mutant mothachail air teòthachd sec31-1 (Figear 4 agus Film S4). Às dèidh don ER a bhith air a chumail aig 37°C agus an uairsin air a leigeil ma sgaoil aig 24°C, cha robh a’ mhòr-chuid den Gas1-GFP ùr-shintéisichte air a chruinneachadh agus air a sgaoileadh air feadh membran an ER, mar a chithear le miocroscopan àbhaisteach (Figear 4, A agus B). A bharrachd air an sin, tha ceudad mòr de ERES (67%) a’ toirt a-steach dà sheòrsa bathar co-shuidhichte ann (Figear 4D). Tha Pannalan 1 agus 2 de Fhigear 4C a’ sealltainn dà eisimpleir àbhaisteach de ERES le Gas1-GFP agus Mid2-GFP a’ dol thairis air a chèile. A bharrachd air an sin, chaidh an dà bhathar fhastadh a-steach don aon ERES (Figear 4E, pannal 3 agus film S4). Mar sin, tha na toraidhean againn a’ nochdadh gu bheil fad an t-sreath ceramide acyl ann am membran an ER na fheart cudromach a tha a’ dearbhadh cruinneachadh agus seòrsachadh pròtain ER.
Ceallan Sec31-1 GhLag1 a’ cur an cèill dìomhaireachdan air an adhbhrachadh le galactose, Gas1-GFP (GPI-AP, uaine) agus Mid2-iRFP (TMP, gorm) agus Sec13-mCherry (ERES, magenta) le bileag ERES bun-reachdail. Goir aig 37°C. Lean air adhart airson 30 mionaid, leig sìos gu 24°C gus dìomhaireachdan a leigeil ma sgaoil, agus dèan dealbh le SCLIM an dèidh 20 mionaid. (A gu C) Ìomhaighean ro-mheasaidh 2D riochdachail (A; bàr sgèile, 1μm) no ìomhaighean leth-chruinne cealla 3D (B agus C; aonad sgèile, 0.45μm) de na 10 earrannan-z air an comharrachadh le bathar agus ERES. Tha am pannal ìosal ann an (B) agus am pannal ann an (C) a’ taisbeanadh ìomhaighean giullaichte gus dìreach na bathar a tha an làthair ann an ERES (magenta) [Gas1-GFP (liath) agus Mid2-iRFP (gorm aotrom)] a thaisbeanadh. (C) Saighead lìonta geal: ERES, bathar a’ dol thairis air a chèile. Saighead fhosgailte: Chan eil ach aon nì ann an ERES. Pannal ìosal: Tha bathar a tha a’ dol thairis air a chèile (1 agus 2) aig an ERES taghte air a chomharrachadh ann an (C). Bàr sgèile, 100 nm. (D) Meudachadh an dealbh-mhicrograf a tha air a mhìneachadh ann an (C). Anns na h-aonadan GhLag1 sec31-1 agus sec31-1, chan eil ach aon chargo (Gas1-GFP no Mid2-iRFP) air a ghabhail a-steach, agus an ceudad cuibheasach de ERES airson cargo iomallach agus cargo a tha a’ dol thairis air a chèile. Ann an trì deuchainnean neo-eisimeileach, n = 432 ann an 54 ceallan (sec31-1) agus n = 430 ann an 47 ceallan (sec31-1 GhLag1). Bàr mearachd = SD. Deuchainn-t neo-phàraichte dà-earballach. *** P = 0.0002 (sec31-1) agus ** P = 0.0031 (sec31-1 GhLag1). (E) Ìomhaigh 3D de ERES taghte le cargo a tha a’ dol thairis air a chèile (3) air a chomharrachadh ann an (C). Tha Gas1-GFP (uaine) agus Mid2-iRFP (gorm) a’ tighinn faisg air ERES (magenta) bhon aon taobh agus a’ fuireach san aon raon cuibhrichte ERES. Bàr-sgèile, 100 nm.
Tha an sgrùdadh seo a’ toirt seachad fianais dhìreach in vivo gu bheil luchdan pròtain stèidhichte air lipid air an seòrsachadh ann an làraichean às-mhalairt roghnach anns an t-slighe dìomhair, agus a’ nochdadh cho cudromach sa tha fad slabhraidh acyl airson roghnachd seòrsachaidh. A’ cleachdadh dòigh-obrach microscopaidh chumhachdach is ùr-nodha ris an canar SCLIM, sheall sinn an Gas1-GFP ùr-shintéisichte (prìomh GPI-AP membran plasma le cuibhreann lipid ceramide slabhraidh acyl (C26) glè fhada) ann am beirm). Tha na roinnean a tha cruinnichte ann an ERan fa leth co-cheangailte ri ERES sònraichte, agus tha pròtainean a tha air an dìomhair thar-membran air an sgaoileadh air feadh membran an ER (Figear 1). A bharrachd air an sin, bidh an dà sheòrsa bathar seo a’ dol a-steach do ERES eadar-dhealaichte gu roghnach (Figear 2). Tha fad slabhraidh acyl a’ ceramide ceallach anns a’ membran air a lughdachadh bho C26 gu C18-C16, tha cruinneachadh Gas1-GFP air a bhriseadh a-steach don roinn ER fa leth, agus tha Gas1-GFP air ath-stiùireadh gus an ER fhàgail leis a’ phròtain thar-membran tron ​​​​aon ERES (Figear 3 agus Figear 3). 4).
Ged a bhios GPI-AP a’ cleachdadh uidheam pròtain sònraichte gus ER fhàgail, fhuair sinn a-mach nach eil dealachadh an urra ri ceramide C26 an urra ri eadar-obrachaidhean pròtain eadar-dhealaichte a dh’ fhaodadh leantainn gu speisealachadh ERES (Figearan S4 agus S5). An àite sin, tha na co-dhùnaidhean againn a’ toirt taic do uidheam seòrsachaidh eile air a stiùireadh le cruinneachadh pròtain stèidhichte air lipid agus às deidh sin cuir às do luchdan eile. Tha na beachdan againn a’ nochdadh nach eil am pròtain dìomhair thar-membrane Mid2-iRFP anns an roinn no cruinneachadh Gas1-GFP co-cheangailte ri ERES sònraichte, a tha a’ nochdadh gun cuidich cruinneachadh GPI-AP an urra ri ceramide C26 le bhith gan faighinn a-steach don ERES buntainneach, agus aig an aon àm, a’ dùnadh a-mach thar-membrane. Bidh na dìomhaireachdan a’ dol a-steach don ERES sònraichte seo (Figearan 1 agus 2). An coimeas ri sin, chan eil làthaireachd ceramides C18-C16 ann am membran ER ag adhbhrachadh gum bi GPI-AP a’ cruthachadh roinnean no cruinneachaidhean, agus mar sin chan eil iad a’ dùnadh a-mach no a’ cur nan àite pròtainean dìomhair thar-membrane san aon ERES (Figearan 3 agus 4). Mar sin, tha sinn a’ moladh gum bi ceramide C26 a’ stiùireadh dealachadh agus seòrsachadh le bhith a’ comasachadh cruinneachadh phròtainean ceangailte ri ERES sònraichte.
Ciamar a choileanas tu an cruinneachadh seo a tha an urra ri ceramide C26 ann an raon sònraichte den ER? Dh’ fhaodadh claonadh ceramide na membrane dealachadh gu taobhach adhbhrachadh gum bi GPI-AP agus ceramide C26 a’ cruthachadh lipidean beaga agus òrdaichte sa bhad ann an àrainneachd lipid nas neo-riaghailteach membrane an ER anns a bheil glycerolipidean nas giorra agus neo-shàthaichte. Cruinneachaidhean càileachd (17, 18). Faodar na cruinneachaidhean beaga sealach seo a cheangal nas fhaide ri chèile ann an cruinneachaidhean nas motha agus nas seasmhaiche às deidh dhaibh ceangal ris an iom-fhillte p24 (34). A rèir seo, sheall sinn gum feum C26 Gas1-GFP eadar-obrachadh leis an iom-fhillte p24 gus cruinneachaidhean faicsinneach nas motha a chruthachadh (Figear 3). Tha an iom-fhillte p24 na oligomer heterozygous air a dhèanamh suas de cheithir phròtainean transmembrane p24 eadar-dhealaichte ann an giosta (35), a bheir seachad ceangal ioma-bhailteach, a dh’ fhaodadh leantainn gu ceangal-croise de chruinneachaidhean beaga GPI-AP, agus mar sin a’ gineadh cruinneachadh seasmhach nas motha (34). Dh’fhaodadh an eadar-obrachadh eadar ectodomains pròtain GPI-APs cur ri an cruinneachadh cuideachd, mar a chithear rè an còmhdhail Golgi ann an ceallan epithelial polaraichte mamalan (36). Ach, nuair a tha ceramide C18-C16 an làthair anns a’ membran ER, nuair a cheanglas an co-thàthadh p24 ri Gas1-GFP, cha tèid cruinneachaidhean mòra fa leth a chruthachadh. Dh’fhaodadh am meacanaig bunaiteach a bhith an urra ri feartan fiosaigeach is ceimigeach sònraichte a’ cheramide slabhraidh acyl fhada. Tha sgrùdaidhean bith-fiosaigeach air membranan fuadain a’ sealltainn ged a dh’ fhaodas ceramides slabhraidh acyl fada (C24) agus goirid (C18-C16) dealachadh ìrean adhbhrachadh, nach urrainn ach ceramides slabhraidh acyl fada (C24) lùbadh àrd agus lùbadh film adhartachadh gus am film ath-chumadh. Tro iomradh dha chèile (17, 37, 38). Chaidh a shealltainn gu bheil an helix thar-membrane de TMED2, an homolog daonna de Emp24, ag eadar-obrachadh gu roghnach le sphingomyelin stèidhichte air ceramide C18 anns na lobules cytoplasmic (39). A’ cleachdadh atharrais daineamaigs moileciuil (MD), fhuair sinn a-mach gu bheil ceramides C18 agus C26 le chèile a’ cruinneachadh timcheall air na lobules cytoplasmic den helix thar-membrane Emp24, agus tha roghainnean coltach riutha (Figear S6). Is fhiach a thoirt fa-near gu bheil seo a’ nochdadh gum faod helix thar-membrane Emp24 leantainn gu sgaoileadh neo-chothromach de lipids anns a’ membran. Is e seo toradh o chionn ghoirid stèidhichte air ceallan mamalan. Tha atharrais MD coltach ris cuideachd a’ sealltainn làthaireachd lipids ether (40). Mar sin, tha sinn a’ beachdachadh gu bheil ceramide C26 anns an dà lobules de ER26 air a bheairteachadh gu h-ionadail. Nuair a cheanglas GPI-AP anns na lobules luminal gu dìreach ri p24 ioma-bhailteach agus cruinneachadh ceramide C26 timcheall air p24 anns na lobules cytoplasmic, faodaidh e cruinneachadh pròtain agus lùbadh membran a bhrosnachadh tron ​​mheur (41), ag adhbhrachadh gum bi GPI-AP a’ dealachadh ann an roinnean fa leth ri taobh ERES, a tha cuideachd a’ fàbharachadh nan roinnean lùbte gu mòr de membran ER (42). Thug aithisgean roimhe taic don mheacanism a chaidh a mholadh (43, 44). Bidh ceangal ioma-bhailteach oligolectins, pathogens no antibodies ri glycosphingolipids stèidhichte air ceramide (GSL) air membran plasma a’ piobrachadh cruinneachadh mòr GSL, a’ neartachadh dealachadh ìrean agus ag adhbhrachadh deformachadh agus in-ghabhail membran (44). Iwabuchi etc. (43) Chaidh a lorg, nuair a bha slabhraidhean acyl fada (C24) ach chan e slabhraidhean goirid (C16) ann, gun robh an ligand ioma-bhailteach a bha ceangailte ri lactosylceramide GSL ag adhbhrachadh cruthachadh chruinneachaidhean mòra agus dol a-steach don membran, agus tha tar-chur comharran Lyn anns a’ chíteaplasma air na duilleagan air a cheangal ri chèile le slabhraidhean acyl ann an neutrophils ceangailte.
Ann an ceallan epithelial polaraichte mamalan, bidh dùmhlachd lìonra an-aghaidh Golgi (TGN) gu ìre membran plasma apical a’ cumail smachd air dealachadh agus seòrsachadh GPI-AP (10, 45). Tha an cruinneachadh seo air a stiùireadh le oligomerization GPI-AP (36), ach is dòcha gu bheil e cuideachd an urra ri fad slabhraidh ceramide a lorgas sinn ann am beirm. Ged a tha acair stèidhichte air lipid ether aig GPI-AP mamalan, agus gu bheil an structar ceimigeach aige gu math eadar-dhealaichte bhon ceramide slabhraidh acyl glè fhada, lorg sgrùdadh o chionn ghoirid gu bheil feartan agus gnìomh corporra agus ceimigeach coltach ri chèile aig an dà lipid gu mean-fhàsach (40). Mar sin, is dòcha gu bheil am pàirt lipid ether ann an ceallan mamalan coltach ris a’ ceramide C26 ann am beirm, agus is e an obair aige ceangal a dhèanamh ris a’ ceramide slabhraidh fhada anns a’ membran gus cruinneachadh agus seòrsachadh GPI-AP adhartachadh. Ged a dh’ fheumar an comas seo a dhearbhadh gu dìreach fhathast, tha co-dhùnaidhean roimhe a’ toirt taic don bheachd nach eil còmhdhail a’ ceramide slabhraidh acyl fhada gu corp Golgi air a dhèanamh le pròtainean gluasaid cytoplasmic, ach tha e an urra ri co-chur acair GPI mar beirm. Mar sin, tha coltas gu bheil an dòigh-obrach glèidhidh mean-fhàsach comasach air ceramide slabhraidh acyl glè fhada agus GPI-AP (13, 16, 20, 46, 47) a cho-ghiùlan gu roghnach san aon bhileas còmhdhail.
Ann an siostaman cealla epithelial pòlaichte beirm is mamalan, bidh cruinneachadh agus dealachadh GPI-AP bho phròtainean membran plasma eile a’ tachairt mus ruig iad uachdar na cealla. Lorg Paladino et al. (48) air TGN cheallan epithelial pòlaichte mamalan, chan e a-mhàin gu bheil cruinneachadh GPI-AP riatanach airson seòrsachadh roghnach GPI-APs chun membran plasma apical, ach cuideachd a’ riaghladh eagrachadh cruinneachadh GPI-APs agus a ghnìomhachd bhitheòlasach. Uachdar cealla. Ann am beirm, sheall an sgrùdadh seo gum faod cruinneachadh GPI-AP an urra ri ceramide C26 air an ER eagrachadh cruinneachadh agus gnìomhachd gnìomhach GPI-AP air a’ membran plasma a riaghladh (24, 49). A rèir a’ mhodail seo, tha ceallan GhLag1 aileirgeach do luchd-bacadh GPI no drogaichean a bheir buaidh air ionracas balla cealla (28), agus tha an fheum air cruinneachaidhean Gas1-GFP gnìomhach (49) den ceramide bàrr a tha air a dhealbhadh ann am paidhreachadh cheallan beirm a’ nochdadh G​​​ Builean fiseòlasach a dh’ fhaodadh a bhith aig ceallan hLag1. Mearachd GPI-AP. Ach, bidh tuilleadh dheuchainnean ann a bheil eagrachadh gnìomhach uachdar nan cealla air a phrògramachadh bhon ER le dòigh seòrsachaidh stèidhichte air fad lipid mar chuspair ar rannsachaidh san àm ri teachd.
Tha na sreathan Saccharomyces cerevisiae a chaidh a chleachdadh san obair seo air an liostadh ann an Clàr S1. Chaidh na sreathan MMY1583 agus MMY1635 de SCLIM airson ìomhaighean cealla beò a thogail ann an cùl-raon W303. Chaidh na sreathan seo a tha a’ cur an cèill Sec13-mCherry le tag pròtain fluorescent a thogail a’ cleachdadh dòigh stèidhichte air ath-bhualadh slabhraidh polymerase (PCR) le plasmid pFA6a mar theamplaid (23). Chaidh an sreath a tha a’ cur an cèill Mid2-iRFP le bileag pròtain fluorescent fo smachd brosnaichear GAL1 a thogail mar a leanas. Meudachadh PCR de shreath iRFP-KanMx bho vectar pKTiRFP-KAN (tiodhlac bho E. O'Shea, àireamh plasmid Addgene 64687; http://n2t.net/addgene: 64687; comharraiche goireas rannsachaidh (RRID): Addgene_64687) Agus air a chuir a-steach do cheann-C Mid2 dùthchasach. Às dèidh sreath genome Mid2-iRFP a bhith air a mheudachadh agus air a chlònadh a-steach don phromotair GAL1, chaidh a thoirt a-steach do làrach Not I-Sac I den phlasmaid amalachaidh pRS306. Chaidh am plasmid pRGS7 a thig às a sin a dhèanamh loidhneach le Pst I gus a thoirt a-steach do locus URA3.
Tha an gine co-thàthaidh Gas1-GFP air a chur an cèill fo smachd brosnaichear GAL1 anns a’ phlasmaid centromere (CEN), a tha air a thogail mar a leanas. Chaidh sreath Gas1-GFP a mheudachadh le PCR bhon phlasmaid pRS416-GAS1-GFP (24) (tiodhlac bho L. Popolo) agus a chlònadh a-steach don làrach Xma I–Xho I den phlasmaid CEN pBEVY-GL LEU2 (tiodhlac bho C). Miller; Addgene àireamh plasmid 51225; http://n2t.net/addgene: 51225; RRID: Addgene_51225). Chaidh am plasmid a thig às ainmeachadh mar pRGS6. Tha an gine co-thàthaidh Axl2-GFP cuideachd air a chur an cèill fo smachd brosnaichear GAL1 den vectar pBEVY-GL LEU2, agus tha a thogail mar a leanas. Chaidh sreath Axl2-GFP a mheudachadh bho phlasmaid pRS304-p2HSE-Axl2-GFP (23) le PCR, agus chaidh a chlònadh a-steach do làrach Bam HI-Pst I de vectar pBEVY-GL LEU2. Chaidh pRGS12 ainmeachadh air a’ phlasmaid a thig às. Tha sreath nan oligonucleotides a chaidh a chleachdadh san sgrùdadh seo air a liostadh ann an Clàr S2.
Chaidh cur ris a’ ghnè le 0.2% adenine agus 2% glùcois [YP-dextrose (YPD)], meadhan pròtain p (YP) earrann beirm beairteach ann an raffinose [YP-raffinose] (1% earrann beirm agus 2% pròtain ept). (YPR)] no 2% galactose [YP-galactose (YPG)] mar thùs gualain, no ann am meadhan as lugha synthetigeach (0.15% bunait naitridean beirm agus 0.5% sulfate ammonium) gus cur ris na amino-aigéid agus na bunaitean iomchaidh a bha a dhìth airson beathachadh, agus anns an robh 2% glùcois (meadhan as lugha glùcois synthetigeach) no 2% galactose (meadhan as lugha galactose synthetigeach) mar thùs gualain.
Airson ìomhaighean fìor-ùine, chaidh ceallan mutant sec31-1 mothachail air teòthachd a bha a’ cur an cèill an togail fon bhrosnaichear GAL1 fhàs ann am meadhan YPR aig 24°C thar oidhche gu meadhan ìre log. Às deidh inntrigeadh ann an YPG aig 24°C airson 1 uair a thìde, chaidh na ceallan a ghoir ann an SG aig 37°C airson 30 mionaid, agus an uairsin an gluasad gu 24°C gus an leigeil ma sgaoil bhon bhloc dìomhaireachd. Chaidh Concanavalin A a chleachdadh gus na ceallan a dhaingneachadh air sleamhnag glainne agus chaidh ìomhaighean a dhèanamh dhiubh le SCLIM. ’S e measgachadh de mhiocroscop fluorescence Olympus IX-71 inverted agus lionsa ola àireamhach UPlanSApo 100 × 1.4 (Olympus), sganair confocal diosc rothlach aig astar luath agus le co-mheas comharra-gu-fuaim àrd (Yokogawa Electric), speactrometer gnàthaichte, agus fuarachadh gnàthaichte a th’ ann an SCLIM. Faodaidh neartaichear ìomhaigh an t-siostaim (Hamamatsu Photonics) siostam lionsa meudachaidh a thoirt seachad le meudachadh deireannach de × 266.7 agus camara inneal ceangailte ri cosgais a bhios ag iomadachadh dealanan (Hamamatsu Photonics) (21). Tha togail ìomhaigh air a dhèanamh le bathar-bog gnàthaichte (Yokogawa Electric). Airson ìomhaighean 3D, chleachd sinn actuator piezoelectric gnàthaichte gus an lionsa amas a chreathadh gu dìreach, agus chruinnich sinn na pàirtean optigeach 100 nm bho chèile ann an cruach. Tha ìomhaigh an Z-stack air a thionndadh gu dàta voxel 3D, agus tha am gnìomh sgaoilidh puing teòiridheach a thathas a’ cleachdadh airson a’ mhiocroscop confocal diosc rothlach air a chleachdadh airson giullachd dì-chonnspaid le bathar-bog Volocity (PerkinElmer). Le bhith a’ cleachdadh bathar-bog Volocity gus stairsneach a shuidheachadh gu fèin-ghluasadach airson mion-sgrùdadh co-shuidheachaidh, chaidh ERES a’ gabhail a-steach bathar a thomhas. Chaidh mion-sgrùdadh sganadh loidhne a dhèanamh le bhith a’ cleachdadh bathar-bog MetaMorph (Molecular Devices).
Cleachd bathar-bog GraphPad Prism gus cudromachd staitistigeil a dhearbhadh. Airson deuchainn-t dà-earballach Oileanach agus deuchainn àbhaisteach aon-shligheach mion-sgrùdadh atharrachaidh (ANOVA), thathas den bheachd gu bheil buaidh mhòr aig eadar-dhealachaidhean eadar buidhnean air P <0.05 (*).
Airson maicreasgopaidh fluorescence de Gas1-GFP, chaidh na ceallan ìre log fhàs thar oidhche ann an YPD agus an cruinneachadh le bhith gan centrifugachadh, gan nighe dà uair le saline bufaire fosfáit, agus gan goradh air deigh airson co-dhiù 15 mionaidean, agus an uairsin gan leantainn fon mhaicreasgop mar a chaidh a mhìneachadh roimhe Thoir sùil air (24). Chaidh am maicreasgop Leica DMi8 (HCX PL APO 1003/1.40 ola PH3 CS) uidheamaichte le lionsa amas, criathrag L5 (GFP), camara Hamamatsu agus bathar-bog Application Suite X (LAS X) a chleachdadh airson togail.
Chaidh na sampallan a dhì-nàdarrachadh le bufair sampall SDS aig 65°C airson 10 mionaidean, agus an uairsin an sgaradh le electrophoresis gel SDS-polyacrylamide (PAGE). Airson mion-sgrùdadh immunoblotting, chaidh 10 μl den sampall a luchdachadh gach làn. Prìomh antibody: Cleachd polyclonal coineanach an-aghaidh Gas1 aig caolachadh de 1:3000, polyclonal coineanach an-aghaidh Emp24 aig caolachadh de 1:500, agus polyclonal coineanach an-aghaidh GFP (tiodhlac bho H. Riezman) aig caolachadh de 1:3000. Chaidh an antibody monoclonal luchaige an-aghaidh Pgk1 a chleachdadh aig caolachadh de 1:5000 (tiodhlac bho J. de la Cruz). Àrd-antibody: Immunoglobulin G (IgG) gobhar an-aghaidh coineanach ceangailte ri Horseradish peroxidase (HRP) air a chleachdadh aig caolachadh de 1:3000 (Pierce). Chaidh IgG gobhair an-aghaidh luchaige ceangailte ri HRP a chleachdadh aig caolachadh de 1:3000 (Pierce). Chaidh an raon freagairt dìonachd fhaicinn leis an dòigh chemiluminescence de SuperSignal West Pico reagent (Thermo Fisher Scientific).
Mar a chaidh a mhìneachadh ann an (31), chaidh deuchainn nàdarrach imdhíon-dhìolaidh a dhèanamh air a’ phàirt ER bheairtichte. Ann an ùine ghoirid, nigh ceallan beirm le bufair TNE [50 mM tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride agus measgachadh inhibitor protease) aig 600 nm (OD600) aig dùmhlachd optigeach 100 dà uair. Chaidh a bhriseadh le grìogagan glainne, agus an uairsin chaidh sprùilleach nan ceallan agus na grìogagan glainne a thoirt air falbh le bhith gan cur ann an ceud-fhulangas. An uairsin chaidh an t-supernatant a chuir ann an ceud-fhulangas aig 17,000 g airson 15 mionaidean aig 4 ° C. Chaidh am peileat ath-fhulangas ann an TNE agus chaidh digitalis saponin a chur ris gu dùmhlachd deireannach de 1%. Chaidh an crochadh a ghoir airson 1 uair a thìde le cuairteachadh aig 4 ° C, agus an uairsin chaidh na co-phàirtean neo-sholabailte a thoirt air falbh le bhith gan cur ann an ceud-fhulangas aig 13,000 g aig 4 ° C airson 60 mionaidean. Airson dìon-dhìonachadh Gas1-GFP, ro-ghoir an sampall an toiseach le grìogagan agarose falamh (ChromoTek) aig 4°C airson 1 uair a thìde, agus an uairsin goir le GFP-Trap_A (ChromoTek) aig 4°C airson 3 uairean a thìde. Chaidh na grìogagan dìon-dhìonachadh a nighe còig tursan le TNE anns an robh 0.2% digoxigenin, air an cuir às le bufair sampall SDS, air an sgaradh air SDS-PAGE, agus air an sgrùdadh le dìon-bhlotadh.
Mar a chaidh a mhìneachadh ann an (31), chaidh dearbhadh ceangail-tarsainn a dhèanamh air a’ phàirt ER bheairteach. Gu h-aithghearr, chaidh am pàirt ER bheairteach a ghoir le 0.5 mM dithiobis(succinimidyl propionate) (Pierce, Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, USA; 20°C, 20 mionaid). Chaidh an ath-bhualadh ceangail-tarsainn a mhùchadh le bhith a’ cur glycine ris (dùmhlachd deireannach 50 mM, 5 mionaidean, 20°C).
Mar a chaidh a mhìneachadh roimhe (50), chaidh mion-sgrùdadh MS air ceramide ann an sreathan fiadhaich agus GhLag1 a dhèanamh. Ann an ùine ghoirid, chaidh ceallan fhàs gu ìre eas-chruthach (3 gu 4 aonadan OD600/ml) ann an YPD aig 30°C, agus chaidh 25 × 107 ceallan a bhuain. Tha am metabolism air a mhùchadh le searbhag trichloroacetic. Cleachd fuasglaiche às-tharraing [ethanol, uisge, ether, pyridine agus 4.2 N ammonium hydroxide (15:15:5:1:0.018 v/v)] agus 1.2 nmol de ceramide C17 àbhaisteach a-staigh (càileachd 860517, Avanti polar lipid)). Cleachd reagent monomethylamine [methanol, uisge, fuasgladh n-butanol agus methylamine (4:3:1:5 v/v)] gus hydrolysis alcaileach tlàth a dhèanamh air an earrann, agus an uairsin cleachd n-butanol shàthaichte le uisge gus dì-shalannachadh. Mu dheireadh, chaidh an earrann ath-fhulangach ann am fuasglaiche modh dearbhach [clòroform/methanol/uisge (2:7:1) + 5 mM ammonium acetate] agus a stealladh a-steach don speactrometer mais. Chaidh sgrùdadh ioma-ath-bhualadh (MRM) a dhèanamh airson aithneachadh agus tomhas moileciuilean sphingolipid. Tha an speactrometer mais ceithir-phòla treasach TSQ Vantage (Thermo Fisher Scientific) uidheamaichte le stòr ian nanoflow robotach Nanomate HD (Advion Biosciences, Ithaca, NY) airson mion-sgrùdadh lipid. Tha an lùth-bualadh air a bharrrachadh airson gach roinn ceramide. Fhuaireadh dàta MS ann am modh dearbhach. Airson gach mac-samhail bith-eòlasach, is e an comharra lipid meadhan trì tomhasan neo-eisimeileach.
Mar a chaidh a mhìneachadh ann an (31), chaidh na ceallan (800 × 107) a bha a’ cur Gas1-GFP an cèill a chur fo imdhìon-dhìonachadh nàdarra. Chaidh an Gas1-GFP glan a sgaradh le SDS-PAGE agus a ghluasad gu membran polyvinylidene fluoride (PVDF). Chaidh am pròtain fhaicinn le bhith a’ staining PVDF le amide dubh. Chaidh a’ chòmhlan Gas1-GFP a ghearradh bhon PVDF agus a nighe 5 tursan le methanol agus aon uair le uisge ìre cromatagrafaidh leaghaidh-MS (LC-MS). Le bhith a’ goir an stiall membran le 500μl 0.3 M NaOAc (pH 4.0), bufair agus 500μl measgachadh sodium nitrite 1 M ùr-sgaoilte aig 37 ° C airson 3 uairean a thìde, tha am bloigh lipid air a leigeil ma sgaoil bho Gas1-GFP agus air a lysis. Sgaoileadh ceramide fosfáit inosine eadar glucosamine agus inositol (51). Às deidh sin, chaidh an stiall membran a nighe ceithir tursan le uisge ìre LC-MS, a thiormachadh aig teòthachd an t-seòmair, agus a stòradh ann an àile naitridean aig -80 ° C gus an deach a sgrùdadh. Mar smachd, chaidh sampall bàn de membran PVDF a chleachdadh airson gach deuchainn. Chaidh an lipid a chaidh a thoirt a-mach à Gas1-GFP an uairsin a sgrùdadh le MS mar a chaidh a mhìneachadh (50). Ann an ùine ghoirid, chaidh stiallan PVDF anns an robh GPI-lipid ath-fhulang ann an 75μl de fhuasglaiche molltair àicheil [clòroform/methanol (1:2) + 5 mM ammonium acetate] agus chaidh iad tro mhion-sgrùdadh electrospray ionization (ESI)-MRM/MS air gnèithean sphingolipid (TSQ Vantage). Anns a’ chùis seo, fhuaireadh dàta MS ann am modh ian àicheil.
Mar a chaidh ainmeachadh roimhe, chaidh pàirt lipid an acair GPI a sgaradh bhon GPI-AP le bileag [3H]-inositol (16). Chaidh na lipidean a sgaradh le cromagrafaidheachd sreath tana a’ cleachdadh siostam fuasglaiche (55:45:10 cloroform-methanol-0.25% KCl) agus chaidh an dèanamh follaiseach le FLA-7000 (Fujifilm).
Chaidh na ceallan a bha a’ cur Gas1-GFP (600 × 107) an cèill a nighe dà uair le bufair TNE, agus a bhriseadh le grìogagan glainne, agus an uairsin gan cur ann an inneal-snìomh gus sprùilleach cealla agus grìogagan glainne a thoirt air falbh. Chaidh an t-snìomh-shreath an uairsin a chur ann an inneal-snìomh aig 17,000 g airson 1 uair aig 4 ° C. Chaidh am peileat a nighe ann an TNE agus a ghoir le 1 U PI-PLC (Invitrogen) ann an TNE anns an robh 0.2% saponin digitalis airson 1 uair aig 37 ° C. Às deidh an làimhseachadh einnsein, chaidh am membran a thoirt air falbh le bhith ga shnìomh-shreathachadh aig 17,000 g aig 4 ° C airson 1 uair. Gus Gas1-GFP a dhèanamh dìonach, chaidh an t-snìomh-shreath a ghoir le GFP-Trap_A (ChromoTek) aig 4 ° C thar oidhche. Chaidh an Gas1-GFP glan, air a sgaradh le SDS-PAGE, a dhath le gorm soilleir Coomassie. Chaidh a’ chòmhlan dathaidh Gas1-GFP a ghearradh dheth bhon liath a bha timcheall air an uisge-ghiùlan, agus an dèidh alkylation le iodoacetamide agus lughdachadh le dithiothreitol, chaidh cnàmhadh in-gel le trypsin a dhèanamh. Thoir a-mach agus tiormaich peptides tryptic agus peptides le GPI-glycans. Chaidh am peptide tioram a sgaoileadh ann an 20 μl de dh’uisge. Cuir cuibhreann (8μl) a-steach don LC. Chaidh colbh octadecylsilane (ODS) (Develosil 300ODS-HG-5; trast-thomhas a-staigh 150 mm × 1.0 mm; Nomura Chemical, Roinn Aichi, Iapan) a chleachdadh gus peptides a sgaradh fo chumhachan caisead sònraichte. Is e an ìre gluasadach fuasglaiche A (0.08% searbhag formach) agus fuasglaiche B (0.15% searbhag formach ann an 80% acetonitrile). Chaidh siostam Accela HPLC (Thermo Fisher Scientific, Boston, Massachusetts) a chleachdadh gus an colbh a dhòrtadh a-mach le fuasglaiche A taobh a-staigh 55 mionaidean aig ìre sruthadh de 50 μl min-1 airson 5 mionaidean, agus an uairsin chaidh dùmhlachd fhuasglaiche B a mheudachadh gu 40%. (Na Stàitean Aonaichte). Chaidh an eluate a thoirt a-steach gu leantainneach don stòr ian ESI, agus chaidh na peptides tryptic agus na peptides le GPI-glycans a sgrùdadh le LTQ Orbitrap XL (spectrometer mais ribe ian loidhneach measgaichte-orbitrap; Thermo Fisher Scientific). Anns an t-suidheachadh MS, chaidh bholtaids an stòr capillary a shuidheachadh gu 4.5 kV, agus chaidh teòthachd a’ capillary gluasaid a chumail aig 300°C. Chaidh am bholtaids capillary agus bholtaids lionsa an tiùba a shuidheachadh gu 15 V agus 50 V, fa leth. Fhuaireadh dàta MS ann am modh ian dearbhach (rùn de 60,000; cruinneas mais de 10 pàirtean gach millean) ann an raon mais de cho-mheas mais/luchd 300/m/z (m/z) 3000. Gheibhear an dàta MS/MS tron ​​ribe ian anns an LTQ Orbitrap XL [a’ chiad 3 figearan air a bheil an dàta an urra, dealachadh air adhbhrachadh le bualadh (CID)].
Rinneadh atharrais MD le bhith a’ cleachdadh bathar-bog GROMACS (52) agus raon feachd MARTINI 2 (53-55). Chaidh an CHARMM GUI Membrane Builder (56, 57) an uair sin a chleachdadh gus dà-fhilleadh a thogail anns an robh dioleoylphosphatidylcholine (DOPC) agus Cer C18 no DOPC agus Cer C26. Tha topo-eòlas agus co-chomharran Cer C26 air an toirt bho DXCE le bhith a’ toirt air falbh na grìogagan a bharrachd bhon earball sphingosine. Cleachd am pròiseas a tha air a mhìneachadh gu h-ìosal gus an dà-fhilleadh a chothromachadh agus a ruith, an uair sin cleachd na co-chomharran mu dheireadh den t-siostam gus siostam a thogail anns a bheil Emp24. Chaidh fearann ​​​​transmembrane beirm Emp24 (fuigheallan 173 gu 193) a thogail mar α-helix a’ cleachdadh structar moileciuil inneal lèirsinneach MD (VMD) (58). An uair sin, às deidh na lipidean a bha a’ dol thairis air a chèile a thoirt air falbh, chaidh am pròtain a ghràineachadh gu garbh agus a chuir a-steach don dà-fhilleadh a’ cleachdadh CHARMM GUI. Tha 1202 DOPC agus 302 Cer C26 no 1197 DOPC agus 295 Cer C18 agus Emp24 anns an t-siostam mu dheireadh. Ionaich an siostam gu dùmhlachd de 0.150M. Chaidh ceithir leth-bhreacan neo-eisimeileach a dhèanamh airson dà cho-dhèanamh dà-fhilleadh.
Tha an dà-fhilleadh lipid air a chothromachadh le bhith a’ cleachdadh pròiseas CHARMM GUI, a tha a’ toirt a-steach lughdachadh agus an uairsin cothromachadh 405,000 ceum, far a bheil na cuingeadan suidheachaidh air an lughdachadh agus air an cuir às mean air mhean, agus tha an ceum ùine air a mheudachadh bho 0.005 ps gu 0.02 ps. Às dèidh cothromachadh, bidh e a’ toirt a-mach 6 µs le ceum ùine de 0.02 ps. Às dèidh Emp24 a chuir a-steach, cleachd an aon phròiseas CHARMM GUI gus an siostam a lughdachadh agus a chothromachadh, agus an uairsin ruith airson 8 diogan ann an cinneasachadh.
Airson a h-uile siostam, rè a’ phròiseis chothromachaidh, tha am bruthadh fo smachd barostat Berendsen (59), agus rè a’ phròiseis cinneasachaidh, tha am bruthadh fo smachd barostat Parrinello-Rahman (60). Anns a h-uile cùis, is e 1 bar an bruthadh cuibheasach agus thathar a’ cleachdadh sgeama ceangail bruthadh leth-isotropic. Anns a’ phròiseas cothromachaidh agus cinneasachaidh, thathar a’ cleachdadh teirmeastat (61) le ath-chothromachadh astair gus teòthachd mìrean pròtain, lipid agus fuasglaiche a cheangal fa leth. Rè an obrachaidh gu lèir, is e 310K an teòthachd targaid. Tha an eadar-obrachadh neo-cheangailte air a thomhas le bhith a’ gineadh liosta paidhrichean a’ cleachdadh sgeama Verlet le fulangas bufair 0.005. Tha an teirm Coulomb air a thomhas a’ cleachdadh an achaidh ath-bhualadh agus astar gearraidh de 1.1 nm. Tha an teirm Vander Waals a’ cleachdadh sgeama gearraidh le astar gearraidh de 1.1 nm, agus thathar a’ cleachdadh sgeama gearraidh Verlet airson drift a dh’fhaodadh a bhith ann (62).
A’ cleachdadh VMD, is e 0.7 nm an tonn-fhaid gearraidh eadar grìogagan fosfáit DOPC no grìogagan ceramide AM1 agus am pròtain, agus thathar a’ tomhas an àireamh de lipidean a bhios ag eadar-obrachadh leis a’ phròtain. A rèir na foirmle a leanas, obraich a-mach am factar crìonadh-beairteachaidh (DE) mar ann an (63): factar DE = (meud nan lipidean iomlan anns a’ phròtain 0.7) anns a’ phròtain 0.7 (meud Cer ann an lipidean iomlan)
Gheibhear an luach a chaidh aithris mar chuibheasachd, agus is e ceithir lethbhric neo-eisimeileach de SE a th’ anns na bàraichean mearachd. Tha cudromachd staitistigeil an fhactar DE air a thomhas le deuchainn-t [(cuibheasachd DE-factor-1)/SE]. Obraich a-mach luach P bhon t-sgaoileadh aon-earballach.
Chaidh an inneal GROMACS a chleachdadh gus mapa dùmhlachd taobhach 2D den t-siostam anns a bheil Emp24 obrachadh a-mach taobh a-staigh nan 250 ns mu dheireadh den lorg. Gus mapa beairteachaidh/crìonadh ceramide fhaighinn, tha mapa dùmhlachd Cer air a roinn le suim mapa Cer agus DOPC, agus an uairsin air a roinn le dùmhlachd Cer anns a’ bhodhaig. Tha an aon sgèile mapa dathte air a chleachdadh.
Airson stuthan a bharrachd airson an artaigil seo, faic http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/50/eaba8237/DC1
Is e seo artaigil fosgailte a tha air a sgaoileadh fo chumhachan Ceadachas Neo-Mhalairteach Attribution Creative Commons, a leigeas le cleachdadh, sgaoileadh agus ath-riochdachadh ann am meadhan sam bith, fhad ‘s nach eil an cleachdadh deireannach airson buannachd mhalairteach agus gur e am bun-bheachd gu bheil an obair thùsail ceart. Iomradh.
Nota: Chan eil sinn ag iarraidh ort ach do sheòladh puist-d a thoirt seachad gus am bi fios aig an neach a tha thu a’ moladh don duilleag gu bheil thu airson gum faic iad am post-d agus nach e spama a th’ ann. Cha ghlac sinn seòlaidhean puist-d sam bith.
Cleachdar a’ cheist seo gus dearbhadh a bheil thu nad neach-tadhail agus gus casg a chuir air spama fèin-ghluasadach.
Sofia Rodriguez-Gallardo, Kazuo Kurokawa, Susana Sabido-Bozo, Alejandro Cortez · Gomez (Alejandro Cortes-Gomez), Atsuko Ikeda (Atsuko Ikeda), Valeria Zoni (Valeria Zoni), Auxiliadora Aguilera-Romero, Ana Maria Perez -Linezio (Seremiah), Ana Maria Perez - Lopez (Miho Waga), Misako Arman (Misako Arman), Miyako Riman (Miyako Riman), Prow Akira, Stefano Fanny, Akihiko Nakano, Manuel Muniz
Tha ìomhaighean fìor-ùine àrd-rùn 3D a’ nochdadh cho cudromach sa tha fad slabhraidh ceramide airson seòrsachadh phròtainean ann an làraichean toraidh roghnach.
Sofia Rodriguez-Gallardo, Kazuo Kurokawa, Susana Sabido-Bozo, Alejandro Cortez · Gomez (Alejandro Cortes-Gomez), Atsuko Ikeda (Atsuko Ikeda), Valeria Zoni (Valeria Zoni), Auxiliadora Aguilera-Romero, Ana Maria Perez -Linezio (Seremiah), Ana Maria Perez - Lopez (Miho Waga), Misako Arman (Misako Arman), Miyako Riman (Miyako Riman), Prow Akira, Stefano Fanny, Akihiko Nakano, Manuel Muniz
Tha ìomhaighean fìor-ùine àrd-rùn 3D a’ nochdadh cho cudromach sa tha fad slabhraidh ceramide airson seòrsachadh phròtainean ann an làraichean toraidh roghnach.
©2020 Comann Ameireagaidh airson Adhartachadh Saidheans. gach còir glèidhte. Tha AAAS na chom-pàirtiche de HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef agus COUNTER. SaidheansAdvances ISSN 2375-2548.