Roimhe seo, dh’innis sinn gu bheil ìrean serum den metabolite tryptophan a tha air a thoirt bhon ghut, searbhag indole-3-propionic (IPA), nas ìsle ann an euslaintich le fibrosis grùthan. Anns an sgrùdadh seo, rinn sinn sgrùdadh air an transcriptome agus an DNA methylome ann an grùthan reamhar a thaobh ìrean serum IPA, a bharrachd air àite IPA ann a bhith ag adhbhrachadh neo-ghnìomhachadh fenotypic de cheallan stellate hepatic (HSCs) in vitro.
Bha 116 euslaintich reamhar gun tinneas an t-siùcair seòrsa 2 (T2DM) (aois 46.8 ± 9.3 bliadhna; BMI: 42.7 ± 5.0 kg/m²) a fhuair lannsaireachd bariatrach aig Ionad Lannsaireachd Bariatrach Kuopio (KOBS) anns an sgrùdadh. Chaidh ìrean IPA a bha a’ cuairteachadh a thomhas le cromatagrafaidheachd leaghaidh-speictreamachd mais (LC-MS), chaidh mion-sgrùdadh transcriptome grùthan a dhèanamh le sreathanachadh RNA iomlan, agus chaidh mion-sgrùdadh methylation DNA a dhèanamh a’ cleachdadh an Infinium HumanMethylation450 BeadChip. Chaidh ceallan stellate grùthan daonna (LX-2) a chleachdadh airson deuchainnean in vitro.
Bha ìrean IPA serum co-cheangailte ri abairteachadh ghinean a tha an sàs ann an slighean apoptotic, mitophagic, agus fad-beatha san grùthan. B’ e an gine AKT serine/threonine kinase 1 (AKT1) an gine eadar-ghnìomhach as pailte agus as làidire ann am pròifilean tar-sgrìobhaidh an grùthan agus DNA methylation. Dh’ adhbhraich làimhseachadh IPA apoptosis, lughdaich e anail mitochondrial, agus dh’ atharraich e morf-eòlas cealla agus daineamaigs mitochondrial le bhith ag atharrachadh abairteachadh ghinean a tha aithnichte airson fibrosis, apoptosis, agus mairsinneachd cheallan LX-2.
Còmhla, tha an dàta seo a’ toirt taic don bheachd gu bheil buaidhean leigheasach comasach aig IPA agus gun urrainn dha apoptosis adhbhrachadh agus an fheinotype HSC a ghluasad a dh’ionnsaigh staid neo-ghnìomhach, agus mar sin a’ leudachadh a’ chothruim fibrosis grùthan a chasg le bhith a’ cur bacadh air gnìomhachadh HSC agus metabolism mitochondrial.
Tha tricead reamhrachd agus sionndrom metabolach air a bhith co-cheangailte ri àrdachadh ann an tricead galair grùthan geir co-cheangailte ri metabolach (MASLD); tha an galar a’ toirt buaidh air 25% gu 30% den t-sluagh san fharsaingeachd [1]. Is e fibrosis grùthan am prìomh bhuil a th’ aig etiology MASLD, pròiseas fiùghantach air a chomharrachadh le cruinneachadh leantainneach de mhaitrice extracellular fibrous (ECM) [2]. Is iad na prìomh cheallan a tha an sàs ann am fibrosis grùthan ceallan stellate hepatic (HSCs), a tha a’ nochdadh ceithir phenotypes aithnichte: sàmhach, gnìomhach, neo-ghnìomhach, agus senescent [3, 4]. Faodar HSCs a ghnìomhachadh agus eadar-dhealachadh bho chruth sàmhach gu ceallan coltach ri fibroblast iomadachaidh le iarrtasan lùtha àrd, le barrachd abairt de α-smooth muscle actin (α-SMA) agus collagen seòrsa I (Col-I) [5, 6]. Rè tionndadh fibrosis grùthan, thèid HSCs gnìomhaichte a thoirt air falbh tro apoptosis no neo-ghnìomhachadh. Tha na pròiseasan seo a’ gabhail a-steach lùghdachadh ginean fibrogenic agus modulachadh ginean pro-mharbhadh (leithid slighean comharran NF-κB agus PI3K/Akt) [7, 8], a bharrachd air atharrachaidhean ann an daineamaigs agus gnìomh mitochondrial [9].
Chaidh ìrean serum den metabolite tryptophan searbhag indole-3-propionic (IPA), a thèid a thoirt a-mach anns a’ bhroinn, a lorg air an lùghdachadh ann an galairean metabolach daonna a’ gabhail a-steach MASLD [10–13]. Tha IPA co-cheangailte ri in-ghabhail snàithleach daithead, tha e ainmeil airson a bhuaidhean antioxidant agus anti-inflammatory, agus tha e a’ lughdachadh an phenotype steatohepatitis neo-dheoch làidir (NASH) air adhbhrachadh le daithead in vivo agus in vitro [11–14]. Tha beagan fianais a’ tighinn bhon sgrùdadh roimhe againn, a sheall gu robh ìrean serum IPA nas ìsle ann an euslaintich le fibrosis grùthan na ann an euslaintich reamhar às aonais fibrosis grùthan ann an Sgrùdadh Lannsaireachd Bariatric Kuopio (KOBS). A bharrachd air an sin, sheall sinn gum faodadh làimhseachadh IPA lughdachadh a dhèanamh air abairt ginean a tha nan comharran clasaigeach de ghreamachadh cealla, imrich cealla agus gnìomhachadh cealla gas hematopoietic ann am modail cealla stellate hepatic daonna (LX-2) agus gur e metabolite hepatoprotective a dh’ fhaodadh a bhith ann [15]. Ach, chan eil e soilleir fhathast ciamar a bhios IPA ag adhbhrachadh crìonadh fibrosis grùthan le bhith a’ gnìomhachadh apoptosis HSC agus bioenergetics mitochondrial.
An seo, tha sinn a’ sealltainn gu bheil IPA serum co-cheangailte ri abairt ginean a tha beairteach ann an slighean apoptosis, mitophagy, agus fad-beatha ann an grùthan dhaoine reamhar ach nach eil tinneas an t-siùcair seòrsa 2 (KOBS). A bharrachd air an sin, fhuair sinn a-mach gum faod IPA glanadh agus crìonadh cheallan gas hematopoietic gnìomhaichte (HSCn) a bhrosnachadh tron ​​​​t-slighe neo-ghnìomhachaidh. Tha na toraidhean seo a’ nochdadh dreuchd ùr airson IPA, ga dhèanamh na thargaid leigheasach a dh’ fhaodadh a bhith ann airson crìonadh fibrosis grùthan adhartachadh.
Sheall sgrùdadh a rinneadh roimhe ann an cohort KOBS gu robh ìrean IPA nas ìsle san fhuil aig euslaintich le fibrosis grùthan an taca ri euslaintich às aonais fibrosis grùthan [15]. Gus buaidh troimh-chèile a dh’ fhaodadh a bhith aig tinneas an t-siùcair seòrsa 2 a dhùnadh a-mach, fhuair sinn 116 euslaintich reamhar às aonais tinneas an t-siùcair seòrsa 2 (aois chuibheasach ± ​​SD: 46.8 ± 9.3 bliadhna; BMI: 42.7 ± 5.0 kg/m2) (Clàr 1) bhon sgrùdadh KOBS a tha a’ dol air adhart mar shluagh an sgrùdaidh [16]. Thug a h-uile com-pàirtiche cead fiosraichte sgrìobhte agus chaidh pròtacal an sgrùdaidh aontachadh le Comataidh Beusachd Ospadal Siorrachd Savo a Tuath a rèir Dearbhadh Helsinki (54/2005, 104/2008 agus 27/2010).
Chaidh sampallan bith-eòlasach grùthan fhaighinn rè lannsaireachd bariatrach agus chaidh am measadh gu histologach le eòlaichean-patalogaidh eòlach a rèir nan slatan-tomhais a chaidh a mhìneachadh roimhe [17, 18]. Tha geàrr-chunntas air na slatan-tomhais measaidh ann an Clàr a bharrachd S1 agus chaidh am mìneachadh roimhe [19].
Chaidh sampallan serum trosgaidh a sgrùdadh le cromatagrafaidheachd leaghaidh neo-chuimsichte-speictreamachd mais (LC-MS) airson mion-sgrùdadh metabolomics (n = 116). Chaidh sampallan a sgrùdadh le bhith a’ cleachdadh siostam UHPLC-qTOF-MS (1290 LC, 6540 qTOF-MS, Agilent Technologies, Waldbronn, Karlsruhe, a’ Ghearmailt) mar a chaidh a mhìneachadh roimhe19. Bha comharrachadh deoch-isopropyl (IPA) stèidhichte air ùine gleidhidh agus coimeas an speactram MS/MS le inbhean fìor-ghlan. Chaidh dian comharra IPA (farsaingeachd mullaich) a mheas anns a h-uile mion-sgrùdadh a bharrachd [20].
Rinneadh sreath-sgrùdadh RNA an grùthan gu lèir le bhith a’ cleachdadh Illumina HiSeq 2500 agus chaidh an dàta a ro-phròiseasadh mar a chaidh a mhìneachadh roimhe [19, 21, 22]. Rinn sinn mion-sgrùdadh eadar-dhealaichte cuimsichte air tar-sgrìobhaidhean a’ toirt buaidh air gnìomh/biogenesis mitochondrial le bhith a’ cleachdadh 1957 ginean a chaidh a thaghadh bhon stòr-dàta MitoMiner 4.0 [23]. Rinneadh mion-sgrùdadh methylation DNA an grùthan le bhith a’ cleachdadh an Infinium HumanMethylation450 BeadChip (Illumina, San Diego, CA, USA) a’ cleachdadh an aon mhodh-obrach ris an deach a mhìneachadh roimhe [24, 25].
Chaidh ceallan stellate hepatic daonna (LX-2) a thoirt seachad gu coibhneil leis an Ollamh Stefano Romeo agus chaidh an cur agus an cumail ann am meadhan DMEM/F12 (Biowest, L0093-500, 1% Pen/Strep; Lonza, DE17-602E, 2% FBS; Gibco, 10270-106). Gus an dòs obrach de IPA a thaghadh, chaidh ceallan LX-2 a làimhseachadh le diofar dùmhlachdan de IPA (10 μM, 100 μM agus 1 mM; Sigma, 220027) ann am meadhan DMEM/F12 airson 24 uair a thìde. A bharrachd air an sin, gus sgrùdadh a dhèanamh air comas IPA gus HSCn a dhì-ghnìomhachadh, chaidh ceallan LX-2 a làimhseachadh còmhla le 5 ng/ml TGF-β1 (siostaman R&D, 240-B-002/CF) agus 1 mM IPA ann am meadhan gun serum airson 24 uair a thìde. Airson nan smachdan carbaid co-fhreagarrach, chaidh 4 nM HCL anns a bheil 0.1% BSA a chleachdadh airson làimhseachadh TGF-β1 agus chaidh 0.05% DMSO a chleachdadh airson làimhseachadh IPA, agus chaidh an dà chuid a chleachdadh còmhla airson an làimhseachadh measgaichte.
Chaidh apoptosis a mheasadh le bhith a’ cleachdadh Pasgan Lorgaidh Apoptosis FITC Annexin V le 7-AAD (Biolegend, San Diego, CA, USA, Cat# 640922) a rèir stiùiridhean an neach-dèanamh. Gu h-aithghearr, chaidh LX-2 (1 × 105 ceallan/tobar) a chultarachadh thar oidhche ann am pleitean 12-tobar agus an uairsin chaidh an làimhseachadh le iomadh dòs de IPA no IPA agus TGF-β1. An ath latha, chaidh ceallan fleòdraidh agus ceallan ceangailteach a chruinneachadh, an trypsinachadh, an nighe le PBS, an ath-fhulang ann am bufair ceangail Annexin V, agus an goir le FITC-Annexin V agus 7-AAD airson 15 mionaidean.
Chaidh mitochondria ann an ceallan beò a dhath airson gnìomhachd oxidative a’ cleachdadh Mitotracker™ Red CMXRos (MTR) (Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA). Airson deuchainnean MTR, chaidh ceallan LX-2 a ghoir aig dùmhlachdan co-ionnan le IPA agus TGF-β1. Às dèidh 24 uair a thìde, chaidh ceallan beò a thrypsinachadh, a nighe le PBS, agus an uairsin a ghoir le 100 μM MTR ann am meadhan gun serum aig 37 °C airson 20 mionaid mar a chaidh a mhìneachadh roimhe [26]. Airson mion-sgrùdadh morf-eòlas cealla beò, chaidh meud cealla agus iom-fhillteachd cytoplasmach a sgrùdadh a’ cleachdadh paramadairean sgapadh air adhart (FSC) agus sgapadh taobh (SSC), fa leth.
Chaidh an dàta gu lèir (30,000 tachartas) fhaighinn le bhith a’ cleachdadh NovoCyte Quanteon (Agilent) agus chaidh a sgrùdadh le bhith a’ cleachdadh bathar-bog NovoExpress® 1.4.1 no FlowJo V.10.
Chaidh ìre caitheamh ocsaidean (OCR) agus ìre searbhachaidh taobh a-muigh cealla (ECAR) a thomhas ann an àm fìor le bhith a’ cleachdadh Seahorse Extracellular Flux Analyzer (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) uidheamaichte le Seahorse XF Cell Mito Stress a rèir stiùiridhean an neach-dèanamh. Gu h-aithghearr, chaidh 2 × 104 ceallan LX-2 / tobar a chur air truinnsearan cultar cealla XF96. Às deidh goir thar oidhche, chaidh ceallan a làimhseachadh le isopropanol (IPA) agus TGF-β1 (Modhan a bharrachd 1). Chaidh mion-sgrùdadh dàta a dhèanamh le bhith a’ cleachdadh bathar-bog Seahorse XF Wave, anns a bheil an Seahorse XF Cell Energy Phenotype Test Report Generator. Às an seo, chaidh Clàr-amais Slàinte Bith-lùthmhor (BHI) obrachadh a-mach [27].
Chaidh RNA iomlan a thar-sgrìobhadh gu cDNA. Airson modhan sònraichte, faic iomradh [15]. Chaidh ìrean mRNA pròtain searbhagach ribosomal 60S daonna P0 (RPLP0) agus cyclophilin A1 (PPIA) a chleachdadh mar smachdan gine bun-reachdail. Chaidh Siostam PCR Fìor-Ùine QuantStudio 6 pro (Thermo Fisher, Landsmeer, Na Tìrean Ìsle) a chleachdadh leis an TaqMan™ Fast Advanced Master Mix Kit (Applied Biosystems) no an Sensifast SYBR Lo-ROX Kit (Bioline, BIO 94050), agus chaidh fillte abairt gine coimeasach obrachadh a-mach a’ cleachdadh paramadairean rothaireachd luach Ct coimeasach (ΔΔCt) agus an dòigh ∆∆Ct. Tha mion-fhiosrachadh mu na prìomhairean air a thoirt seachad ann an Clàran a bharrachd S2 agus S3.
Chaidh DNA niùclasach (ncDNA) agus DNA mitochondrial (mtDNA) a thoirt a-mach le bhith a’ cleachdadh an inneal fala is clò DNeasy (Qiagen) mar a chaidh a mhìneachadh roimhe [28]. Chaidh an ìre coimeasach de mtDNA obrachadh a-mach le bhith a’ tomhas co-mheas gach roinn mtDNA targaid ris a’ chuibheasachd geoimeatrach de na trì roinnean DNA niùclasach (mtDNA/ncDNA), mar a tha mionaideach ann an Modhan a bharrachd 2. Tha mion-fhiosrachadh mu na prìomhairean airson mtDNA agus ncDNA ri fhaighinn ann an Clàr a bharrachd S4.
Chaidh ceallan beò a dhath le Mitotracker™ Red CMXRos (MTR) (Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA) gus lìonraidhean mitochondrial eadar-cheallach agus intracellular fhaicinn. Chaidh ceallan LX-2 (1 × 104 ceallan/tobar) a chultarachadh air sleamhnagan glainne ann am pleitean cultar bonn glainne co-fhreagarrach (Ibidi GmbH, Martinsried, a' Ghearmailt). Às dèidh 24 uair a thìde, chaidh ceallan LX-2 beò a ghoir le 100 μM MTR airson 20 mionaid aig 37 °C agus chaidh niùclas cealla a dhath le DAPI (1 μg/ml, Sigma-Aldrich) mar a chaidh a mhìneachadh roimhe [29]. Chaidh lìonraidhean mitochondrial fhaicinn le bhith a’ cleachdadh miocroscop Zeiss Axio Observer inverted (Carl Zeiss Microimaging GmbH, Jena, a' Ghearmailt) uidheamaichte le modúl confocal Zeiss LSM 800 aig 37 °C ann an àile tais le 5% CO2 a’ cleachdadh amas 63 × NA 1.3. Fhuair sinn deich ìomhaighean sreath-Z airson gach seòrsa sampall. Tha 30 earrann anns gach sreath Z, gach fear le tiughas de 9.86 μm. Airson gach sampall, chaidh ìomhaighean de dheich raointean seallaidh eadar-dhealaichte fhaighinn a’ cleachdadh bathar-bog ZEN 2009 (Carl Zeiss Microimaging GmbH, Jena, a’ Ghearmailt), agus chaidh mion-sgrùdadh morf-eòlais mitochondrial a dhèanamh a’ cleachdadh bathar-bog ImageJ (v1.54d) [30, 31] a rèir nam paramadairean a tha air am mìneachadh ann an Modhan a bharrachd 3.
Chaidh na ceallan a dhaingneachadh le 2% glutaraldehyde ann am bufair fosfáit 0.1 M, agus an uair sin gan daingneachadh le fuasgladh osmium tetroxide 1% (Sigma Aldrich, MO, USA), mean air mhean gan dì-uisgeachadh le acetone (Merck, Darmstadt, a' Ghearmailt), agus mu dheireadh gan leabachadh ann an roisinn epocsa. Chaidh earrannan tana a dheasachadh agus an dath le 1% uranyl acetate (Merck, Darmstadt, a' Ghearmailt) agus 1% luaidhe citrate (Merck, Darmstadt, a' Ghearmailt). Fhuaireadh ìomhaighean structarail le bhith a' cleachdadh miocroscop dealanach tar-chuir JEM 2100F EXII (JEOL Ltd, Tokyo, Iapan) aig bholtaids luathachaidh de 80 kV.
Chaidh morf-eòlas cheallan LX-2 a chaidh an làimhseachadh le IPA airson 24 uair a thìde a sgrùdadh le microscop eadar-dhealachaidh ìre aig meudachadh 50x a’ cleachdadh microscop solais bun-os-cionn Zeiss (Zeiss Axio Vert.A1 agus AxioCam MRm, Jena, a’ Ghearmailt).
Chaidh dàta clionaigeach a chur an cèill mar chuibheasachd ± claonadh àbhaisteach no meadhan (raon eadar-chairteal: IQR). Chaidh mion-sgrùdadh aon-shligheach air atharrachaidh (caochladairean leantainneach) no deuchainn χ² (caochladairean roinneil) a chleachdadh gus coimeas a dhèanamh eadar na h-eadar-dhealachaidhean eadar na trì buidhnean sgrùdaidh. Chaidh an ìre dearbhach meallta (FDR) a chleachdadh gus ceartachadh airson iomadh deuchainn, agus chaidh ginean le FDR < 0.05 a mheas mar ginean cudromach gu staitistigeil. Chaidh mion-sgrùdadh co-dhàimh Spearman a chleachdadh gus methylation DNA CpG a cheangal ri dian comharra IPA, le luachan p ainmichte (p < 0.05) air an aithris.
Rinneadh mion-sgrùdadh slighe le bhith a’ cleachdadh inneal mion-sgrùdaidh seata gine stèidhichte air an lìon (WebGestalt) airson 268 tar-sgrìobhaidhean (p ainmeach < 0.01), 119 tar-sgrìobhaidhean co-cheangailte ri mitochondria (p ainmeach < 0.05), agus 4350 CpGan a-mach à 3093 tar-sgrìobhaidhean grùthan a bha co-cheangailte ri ìrean IPA serum a bha a’ cuairteachadh. Chaidh an inneal Venny DB (dreach 2.1.0) a tha ri fhaighinn an-asgaidh a chleachdadh gus ginean a tha a’ dol thairis air a chèile a lorg, agus chaidh StringDB (dreach 11.5) a chleachdadh gus eadar-obrachaidhean pròtain-pròtain a dhèanamh follaiseach.
Airson deuchainn LX-2, chaidh sampallan a dhearbhadh airson àbhaisteachd a’ cleachdadh deuchainn D'Agostino-Pearson. Fhuaireadh dàta bho co-dhiù trì ath-aithrisean bith-eòlasach agus chaidh ANOVA aon-shligheach a dhèanamh orra le deuchainn iar-dheuchainn Bonferroni. Chaidh luach-p nas lugha na 0.05 a mheas mar luach cudromach gu staitistigeil. Tha dàta air a thaisbeanadh mar chuibheasachd ± SD, agus tha an àireamh de dheuchainnean air a chomharrachadh anns gach figear. Chaidh a h-uile mion-sgrùdadh agus graf a dhèanamh a’ cleachdadh bathar-bog staitistigeil GraphPad Prism 8 airson Windows (GraphPad Software Inc., dreach 8.4.3, San Diego, USA).
An toiseach, rinn sinn sgrùdadh air a’ cheangal eadar ìrean IPA serum agus tar-sgrìobhaidhean an grùthan, a’ chuirp gu lèir, agus mitochondrial. Anns a’ phròifil tar-sgrìobhaidh iomlan, b’ e MAPKAPK3 an gine as làidire a bha co-cheangailte ri ìrean IPA serum (FDR = 0.0077; kinase pròtain gnìomhaichte le mitogen-activated-protein kinase 3); anns a’ phròifil tar-sgrìobhaidh co-cheangailte ri mitochondria, b’ e AKT1 an gine as làidire a bha co-cheangailte (FDR = 0.7621; AKT serine/threonine kinase 1) (Faidhle a bharrachd 1 agus faidhle a bharrachd 2).
An uair sin rinn sinn mion-sgrùdadh air tar-sgrìobhaidhean cruinneil (n = 268; p < 0.01) agus tar-sgrìobhaidhean co-cheangailte ri mitochondria (n = 119; p < 0.05), agus aig a’ cheann thall chomharraich sinn gur e apoptosis an t-slighe as cudromaiche san fharsaingeachd (p = 0.0089). Airson tar-sgrìobhaidhean mitochondrial co-cheangailte ri ìrean IPA serum, chuir sinn fòcas air apoptosis (FDR = 0.00001), mitophagy (FDR = 0.00029), agus slighean comharran TNF (FDR = 0.000006) (Figear 1A, Clàr 2, agus Figearan a bharrachd 1A-B).
Mion-sgrùdadh co-thàthaichte air tar-sgrìobhaidhean cruinneil, co-cheangailte ri mitochondria, agus methylation DNA ann an grùthan daonna an co-cheangal ri ìrean IPA serum. Tha A a’ riochdachadh 268 tar-sgrìobhaidhean cruinneil, 119 tar-sgrìobhaidhean co-cheangailte ri mitochondria, agus tar-sgrìobhaidhean DNA methylated a tha air am mapadh gu 3092 làrach CpG co-cheangailte ri ìrean IPA serum (luachan p < 0.01 airson tar-sgrìobhaidhean cruinneil agus DNA methylated, agus luachan p < 0.05 airson tar-sgrìobhaidhean mitochondrial). Tha na prìomh thar-sgrìobhaidhean co-thàthaichte air an sealltainn sa mheadhan (AKT1 agus YKT6). B Chaidh mapa eadar-obrachaidh nan 13 ginean leis an sgòr eadar-obrachaidh as àirde (0.900) le ginean eile a thogail bho na 56 ginean co-thàthaichte (roinn loidhne dhubh) a bha gu mòr co-cheangailte ri ìrean IPA serum a’ cleachdadh an inneal air-loidhne StringDB. Uaine: Ginean air am mapadh chun phàirt ceallach Gene Ontology (GO): mitochondria (GO:0005739). ’S e AKT1 am pròtain leis an sgòr as àirde (0.900) airson eadar-obrachadh le pròtainean eile stèidhichte air an dàta (stèidhichte air mèinneadh teacsa, deuchainnean, stòran-dàta, agus co-chur an cèill). Tha nodan lìonra a’ riochdachadh phròtainean, agus oirean a’ riochdachadh ceanglaichean eadar pròtainean.
Leis gum faod metabolites microbiota gut co-dhèanamh epigenetic a riaghladh tro methylation DNA [32], rinn sinn sgrùdadh a bheil ìrean IPA serum co-cheangailte ri methylation DNA an grùthan. Fhuair sinn a-mach gu robh an dà phrìomh làrach methylation co-cheangailte ri ìrean IPA serum faisg air roinn 3 beairteach ann am proline-serine (C19orf55) agus teaghlach pròtain clisgeadh teas B (beag) ball 6 (HSPB6) (Faidhle a bharrachd 3). Bha methylation DNA de 4350 CpG (p < 0.01) co-cheangailte ri ìrean IPA serum agus bha e beairteach ann an slighean riaghlaidh fad-beatha (p = 0.006) (Figear 1A, Clàr 2, agus Figear a bharrachd 1C).
Gus tuigse fhaighinn air na dòighean bith-eòlasach a tha aig bonn nan ceanglaichean eadar ìrean IPA serum, tar-sgrìobhaidhean cruinneil, tar-sgrìobhaidhean co-cheangailte ri mitochondria, agus methylation DNA ann an grùthan daonna, rinn sinn mion-sgrùdadh tar-lùbaidh air na ginean a chaidh an comharrachadh anns an anailis slighe roimhe (Figear 1A). Sheall toraidhean mion-sgrùdadh beairteachaidh slighe nan 56 ginean tar-lùbaidh (taobh a-staigh na loidhne dhubha ann am Figear 1A) gun do chomharraich slighe apoptosis (p = 0.00029) dà ghine a bha cumanta do na trì mion-sgrùdaidhean: AKT1 agus YKT6 (homolog YKT6 v-SNARE), mar a chithear anns an diagram Venn (Figear a bharrachd 2 agus Figear 1A). Gu inntinneach, fhuair sinn a-mach gu robh AKT1 (cg19831386) agus YKT6 (cg24161647) co-cheangailte gu dearbhach ri ìrean IPA serum (Faidhle a bharrachd 3). Gus eadar-obrachaidhean pròtain a dh’fhaodadh a bhith ann eadar toraidhean gine a chomharrachadh, thagh sinn 13 ginean leis an sgòr roinne cumanta as àirde (0.900) am measg 56 ginean tar-lùbaidh mar chur-a-steach agus thog sinn mapa eadar-obrachaidh. A rèir na h-ìre misneachd (misneachd imeallach), bha an gine AKT1 leis an sgòr as àirde (0.900) aig a’ mhullach (Figear 1B).
Stèidhichte air an anailis slighe, fhuair sinn a-mach gur e apoptosis am prìomh shlighe, agus mar sin rinn sinn sgrùdadh air an toireadh làimhseachadh IPA buaidh air apoptosis HSCs in vitro. Sheall sinn roimhe seo nach robh diofar dòsan de IPA (10 μM, 100 μM, agus 1 mM) puinnseanta do cheallan LX-2 [15]. Sheall an sgrùdadh seo gun do mheudaich làimhseachadh IPA aig 10 μM agus 100 μM an àireamh de cheallan beòthail agus necrotic. Ach, an taca ris a’ bhuidheann smachd, lùghdaich beòthail cealla aig dùmhlachd 1 mM IPA, agus dh’fhan an ìre necrosis cealla gun atharrachadh (Figear 2A, B). An uairsin, gus an dùmhlachd as fheàrr a lorg gus apoptosis adhbhrachadh ann an ceallan LX-2, rinn sinn deuchainn air 10 μM, 100 μM, agus 1 mM IPA airson 24 uair (Figear 2A-E agus Figear Taiceil 3A-B). Gu inntinneach, lùghdaich IPA 10 μM agus 100 μM an ìre apoptosis (%), ge-tà, mheudaich IPA 1 mM ìre apoptosis fadalach agus apoptosis (%) an taca ris a’ smachd agus mar sin chaidh a thaghadh airson deuchainnean a bharrachd (Figearan 2A–D).
Bidh IPA ag adhbhrachadh apoptosis ann an ceallan LX-2. Chaidh dòigh-dathaidh dùbailte Annexin V agus 7-AAD a chleachdadh gus an ìre apoptotic agus morf-eòlas nan ceallan a thomhas le cytometry sruthadh. Chaidh ceallan BA a ghoir le 10 μM, 100 μM agus 1 mM IPA airson 24 uair no le F–H TGF-β1 (5 ng/ml) agus 1 mM IPA ann am meadhan gun serum airson 24 uair. A: ceallan beò (Annexin V -/ 7AAD-); B: ceallan necrotic (Annexin V -/ 7AAD+); C, F: tràth (Annexin V +/ 7AAD-); D, G: fadalach (Annexin V+/7AAD.+); E, H: ceudad de cheallan apoptotic tràth is fadalach iomlan ann an ìre apoptotic (%). Tha dàta air a chur an cèill mar chuibheasach ± ​​SD, n = 3 deuchainnean neo-eisimeileach. Chaidh coimeasan staitistigeil a dhèanamh a’ cleachdadh ANOVA aon-shligheach le deuchainn post hoc Bonferroni. *p < 0.05; ****p < 0.0001
Mar a sheall sinn roimhe, faodaidh 5 ng/ml TGF-β1 gnìomhachadh HSC a bhrosnachadh le bhith ag àrdachadh abairt ginean comharrachaidh clasaigeach [15]. Chaidh ceallan LX-2 a làimhseachadh le 5 ng/ml TGF-β1 agus 1 mM IPA ann an co-bhonn (Figear 2E–H). Cha do dh’atharraich làimhseachadh TGF-β1 an ìre apoptosis, ge-tà, mheudaich co-làimhseachadh IPA apoptosis fadalach agus ìre apoptosis (%) an taca ri làimhseachadh TGF-β1 (Figear 2E–H). Tha na toraidhean seo a’ nochdadh gum faod 1 mM IPA apoptosis adhartachadh ann an ceallan LX-2 gu neo-eisimeileach bho bhrosnachadh TGF-β1.
Rinn sinn tuilleadh rannsachaidh air buaidh IPA air anail mitochondrial ann an ceallan LX-2. Sheall na toraidhean gun do lughdaich 1 mM IPA paramadairean ìre caitheamh ocsaidean (OCR): anail neo-mitochondrial, anail basal agus as àirde, aodion proton agus cinneasachadh ATP an taca ris a’ bhuidheann smachd (Figear 3A, B), agus cha do dh’atharraich clàr-amais slàinte bith-lùthmhor (BHI).
Bidh IPA a’ lughdachadh anail mitochondrial ann an ceallan LX-2. Tha lùb anail mitochondrial (OCR) air a thaisbeanadh mar pharaimeatairean anail mitochondrial (anail neo-mitochondrial, anail basal, anail as àirde, aodion proton, gineadh ATP, SRC agus BHI). Chaidh ceallan A agus B a ghoir le 10 μM, 100 μM agus 1 mM IPA airson 24 uair, fa leth. Chaidh ceallan C agus D a ghoir le TGF-β1 (5 ng / ml) agus 1 mM IPA ann am meadhan saor bho serum airson 24 uair, fa leth. Chaidh a h-uile tomhas a dhèanamh àbhaisteach gu susbaint DNA a’ cleachdadh an inneal CyQuant. BHI: clàr-amais slàinte bith-lùthmhor; SRC: comas glèidhte analach; OCR: ìre caitheamh ocsaidean. Tha dàta air a thaisbeanadh mar chuibheasachd ± claonadh àbhaisteach (SD), n = 5 deuchainnean neo-eisimeileach. Chaidh coimeasan staitistigeil a dhèanamh a’ cleachdadh ANOVA aon-shligheach agus deuchainn post hoc Bonferroni. *p < 0.05; **p < 0.01; agus ***p < 0.001
Gus tuigse nas coileanta fhaighinn air buaidh IPA air pròifil bith-lùth cheallan LX-2 air an gnìomhachadh le TGF-β1, rinn sinn mion-sgrùdadh air fosfaireachadh oxidative mitochondrial le OCR (Figear 3C, D). Sheall na toraidhean gum b’ urrainn do làimhseachadh TGF-β1 an anail as àirde, comas glèidhte analach (SRC) agus BHI a lùghdachadh an taca ris a’ bhuidheann smachd (Figear 3C, D). A bharrachd air an sin, lùghdaich an làimhseachadh measgaichte anail bunaiteach, aodion proton agus cinneasachadh ATP, ach bha SRC agus BHI gu math nas àirde na an fheadhainn a chaidh a làimhseachadh le TGF-β1 (Figear 3C, D).
Rinn sinn cuideachd an “Deuchainn Fenotype Lùth Ceallach” a thug bathar-bog Seahorse seachad (Figear a bharrachd 4A–D). Mar a chithear ann am Figear a bharrachd 3B, chaidh comasan metabolach OCR agus ECAR a lùghdachadh an dèidh làimhseachadh TGF-β1, ge-tà, cha deach eadar-dhealachadh sam bith fhaicinn anns na buidhnean làimhseachaidh measgaichte agus IPA an taca ris a’ bhuidheann smachd. A bharrachd air an sin, chaidh ìrean bunaiteach agus cuideam OCR a lùghdachadh an dèidh làimhseachadh measgaichte agus IPA an taca ris a’ bhuidheann smachd (Figear a bharrachd 4C). Gu inntinneach, chaidh pàtran coltach ris fhaicinn le leigheas measgaichte, far nach deach atharrachadh sam bith fhaicinn ann an ìrean bunaiteach agus cuideam ECAR an taca ri làimhseachadh TGF-β1 (Figear a bharrachd 4C). Ann an HSCn, cha do dh’ atharraich an lùghdachadh ann am fosfaireachadh oxidative mitochondrial agus comas làimhseachadh measgaichte SCR agus BHI ath-nuadhachadh an dèidh nochdadh do làimhseachadh TGF-β1 an comas metabolach (OCR agus ECAR). Còmhla, tha na toraidhean seo a’ nochdadh gum faodadh IPA bith-lùth a lughdachadh ann an HSCn, a’ moladh gum faodadh IPA pròifil lùthmhor nas ìsle adhbhrachadh a ghluaiseas an fhenotype HSC a dh’ionnsaigh neo-ghnìomhachd (Figear a bharrachd 4D).
Chaidh buaidh IPA air daineamaigs mitochondrial a sgrùdadh le bhith a’ cleachdadh tomhas trì-thaobhach de morf-eòlas mitochondrial agus ceanglaichean lìonra a bharrachd air dathachadh MTR (Figear 4 agus Figear a bharrachd 5). Tha Figear 4 a’ sealltainn, an taca ris a’ bhuidheann smachd, gun do lughdaich làimhseachadh TGF-β1 an raon uachdar cuibheasach, àireamh mheuran, fad iomlan mheuran, agus àireamh snaim mheuran (Figear 4A agus B) agus gun do dh’ atharraich e co-roinn nam mitochondria bho morf-eòlas cruinneach gu morf-eòlas eadar-mheadhanach (Figear 4C). Cha do lughdaich ach làimhseachadh IPA meud cuibheasach mitochondrial agus dh’ atharraich e co-roinn nam mitochondria bho morf-eòlas cruinneach gu morf-eòlas eadar-mheadhanach an taca ris a’ bhuidheann smachd (Figear 4A). An coimeas ri sin, dh’ fhan cruinneach, fad cuibheasach mheuran, agus gnìomhachd mitochondrial air a mheasadh le MTR an urra ri comas membran mitochondrial (Figear 4A agus E) gun atharrachadh agus cha robh na paramadairean sin eadar-dhealaichte eadar buidhnean. Còmhla, tha na toraidhean seo a’ moladh gu bheil coltas gu bheil làimhseachadh TGF-β1 agus IPA ag atharrachadh cumadh agus meud mitochondrial a bharrachd air iom-fhillteachd lìonra ann an ceallan LX-2 beò.
Bidh IPA ag atharrachadh daineamaigs mitochondrial agus pailteas DNA mitochondrial ann an ceallan LX-2. A. Dealbhan confocal riochdachail de cheallan LX-2 beò air an goir le TGF-β1 (5 ng/ml) agus 1 mM IPA airson 24 uair ann am meadhan saor bho serum a’ sealltainn lìonraidhean mitochondrial air an staineadh le Mitotracker™ Red CMXRos agus niuclasan air an staineadh gorm le DAPI. Bha co-dhiù 15 ìomhaigh gach buidheann anns an dàta gu lèir. Fhuair sinn 10 ìomhaighean Z-stack airson gach seòrsa sampall. Bha 30 sliseag anns gach sreath Z-axis, gach fear le tiugh de 9.86 μm. Bàr sgèile: 10 μm. B. Nithean riochdachail (mitochondria a-mhàin) air an comharrachadh le bhith a’ cur stairsneach atharrachail ris an ìomhaigh. Chaidh mion-sgrùdadh cainníomach agus coimeas de cheanglaichean lìonra morf-eòlach mitochondrial a dhèanamh airson a h-uile cealla anns gach buidheann. C. Tricead co-mheasan cumadh mitochondrial. Tha luachan faisg air 0 a’ comharrachadh chumaidhean cruinn, agus tha luachan faisg air 1 a’ comharrachadh chumaidhean filamentous. D Chaidh susbaint DNA mitochondrial (mtDNA) a dhearbhadh mar a chaidh a mhìneachadh ann an Stuthan agus Modhan. Rinneadh mion-sgrùdadh air E Mitotracker™ Red CMXRos le cytometry sruthadh (30,000 tachartas) mar a chaidh a mhìneachadh ann an Stuthan agus Modhan. Tha dàta air a thaisbeanadh mar chuibheasachd ± SD, n = 3 deuchainnean neo-eisimeileach. Rinneadh coimeasan staitistigeil a’ cleachdadh ANOVA aon-shligheach agus deuchainn iar-chòd Bonferroni. *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001; ****p < 0.0001
An uairsin rinn sinn mion-sgrùdadh air susbaint mtDNA ann an ceallan LX-2 mar chomharradh air àireamh mitochondrial. An coimeas ris a’ bhuidheann smachd, bha susbaint mtDNA air a mheudachadh anns a’ bhuidheann a fhuair làimhseachadh le TGF-β1 (Figear 4D). An coimeas ris a’ bhuidheann a fhuair làimhseachadh le TGF-β1, bha susbaint mtDNA air a lùghdachadh anns a’ bhuidheann làimhseachaidh measgaichte (Figear 4D), a’ moladh gum faodadh IPA susbaint mtDNA a lughdachadh agus is dòcha àireamh mitochondrial a bharrachd air anail mitochondrial (Figear 3C). A bharrachd air an sin, bha coltas ann gun do lughdaich IPA susbaint mtDNA anns an làimhseachadh measgaichte ach cha do chuir e buaidh air gnìomhachd mitochondrial air a bhrosnachadh le MTR (Figearan 4A–C).
Rinn sinn sgrùdadh air a’ cheangal eadar IPA agus ìrean mRNA nan ginean co-cheangailte ri fibrosis, apoptosis, mairsinneachd, agus daineamaigs mitochondrial ann an ceallan LX-2 (Figear 5A–D). An coimeas ris a’ bhuidheann smachd, sheall a’ bhuidheann a fhuair làimhseachadh le TGF-β1 barrachd abairt de ghinean leithid slabhraidh collagen seòrsa I α2 (COL1A2), α-smooth muscle actin (αSMA), matrix metalloproteinase 2 (MMP2), inhibitor clò metalloproteinase 1 (TIMP1), agus gine coltach ri dynamin 1 (DRP1), a’ nochdadh barrachd fibrosis agus gnìomhachaidh. A bharrachd air an sin, an coimeas ris a’ bhuidheann smachd, lughdaich làimhseachadh TGF-β1 ìrean mRNA gabhadair pregnane X niùclasach (PXR), caspase 8 (CASP8), MAPKAPK3, inhibitor cealla-B α, enhancer of niùclasach factor κ gine light peptide (NFκB1A), agus inhibitor of niùclasach factor κB kinase subunit β (IKBKB) (Figear 5A–D). An coimeas ri làimhseachadh TGF-β1, lughdaich làimhseachadh measgaichte le TGF-β1 agus IPA abairt COL1A2 agus MMP2, ach mheudaich e ìrean mRNA PXR, TIMP1, lymphoma-2 cealla-B (BCL-2), CASP8, NFκB1A, NFκB1-β, agus IKBKB. Lùghdaich làimhseachadh IPA gu mòr abairt MMP2, pròtain X co-cheangailte ri Bcl-2 (BAX), AKT1, pròtain atrophy optic 1 (OPA1), agus pròtain fusion mitochondrial 2 (MFN2), ach chaidh abairt CASP8, NFκB1A, NFκB1B, agus IKBKB a mheudachadh an taca ris a’ bhuidheann smachd. Ach, cha deach eadar-dhealachadh sam bith a lorg ann an abairt caspase-3 (CASP3), factar gnìomhachaidh peptidase apoptotic 1 (APAF1), pròtain fusion mitochondrial 1 (MFN1), agus pròtain fission 1 (FIS1). Còmhla, tha na toraidhean seo a’ moladh gu bheil làimhseachadh IPA ag atharrachadh mar a bhios ginean co-cheangailte ri fibrosis, apoptosis, mairsinneachd, agus daineamaigs mitochondrial ag obair. Tha an dàta againn a’ moladh gu bheil làimhseachadh IPA a’ lughdachadh fibrosis ann an ceallan LX-2; aig an aon àm, bidh e a’ brosnachadh mairsinneachd le bhith ag atharrachadh an fheinotìp a dh’ionnsaigh neo-ghnìomhachd.
Bidh IPA ag atharrachadh mar a bhios ginean fibroblast, apoptotic, beòthalachd, agus daineamaigs mitochondrial gan cur an cèill ann an ceallan LX-2. Bidh histograman a’ taisbeanadh cur an cèill mRNA an coimeas ri smachd endogenous (RPLP0 no PPIA) às dèidh do cheallan LX-2 a bhith air an brosnachadh le TGF-β1 agus IPA ann am meadhan saor bho serum airson 24 uair a thìde. Tha A a’ comharrachadh fibroblasts, tha B a’ comharrachadh ceallan apoptotic, tha C a’ comharrachadh ceallan a tha beò, agus tha D a’ comharrachadh cur an cèill ginean daineamaigs mitochondrial. Tha dàta air a thaisbeanadh mar chuibheasachd ± claonadh àbhaisteach (SD), n = 3 deuchainnean neo-eisimeileach. Chaidh coimeasan staitistigeil a dhèanamh a’ cleachdadh ANOVA aon-shligheach agus deuchainn post hoc Bonferroni. *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001; ****p < 0.0001
An uair sin, chaidh atharrachaidhean ann am meud cealla (FSC-H) agus iom-fhillteachd cytoplasmic (SSC-H) a mheasadh le cytometry sruthadh (Figear 6A,B), agus chaidh atharrachaidhean ann am morf-eòlas cealla às dèidh làimhseachadh IPA a mheasadh le microscopy dealanach tar-chuir (TEM) agus microscopy eadar-dhealachaidh ìre (Figear a bharrachd 6A-B). Mar a bha dùil, mheudaich ceallan anns a’ bhuidheann a fhuair làimhseachadh le TGF-β1 ann am meud an taca ris a’ bhuidheann smachd (Figear 6A,B), a’ sealltainn leudachadh clasaigeach an reticulum endoplasmic garbh (ER*) agus phagolysosomes (P), a’ nochdadh gnìomhachadh ceallan gas hematopoietic (HSC) (Figear a bharrachd 6A). Ach, an taca ris a’ bhuidheann a fhuair làimhseachadh le TGF-β1, chaidh meud nan ceallan, iom-fhillteachd cytoplasmic (Figear 6A,B), agus susbaint ER* a lùghdachadh anns a’ bhuidheann làimhseachaidh measgachadh TGF-β1 agus IPA (Figear a bharrachd 6A). A bharrachd air an sin, lùghdaich làimhseachadh IPA meud nan ceallan, iom-fhillteachd cytoplasmic (Figearan 6A,B), susbaint P agus ER* (Figear a bharrachd 6A) an taca ris a’ bhuidheann smachd. A bharrachd air sin, mheudaich susbaint nan ceallan apoptotic an dèidh 24 uair de làimhseachadh IPA an taca ris a’ bhuidheann smachd (saigheadan geala, Figear Taiceil 6B). Còmhla, tha na toraidhean seo a’ moladh gum faod 1 mM IPA apoptosis HSC a bhrosnachadh agus na h-atharrachaidhean ann am paramadairean morf-eòlach cealla air an adhbhrachadh le TGF-β1 a thionndadh air ais, agus mar sin a’ riaghladh meud agus iom-fhillteachd nan ceallan, a dh’ fhaodadh a bhith co-cheangailte ri neo-ghnìomhachadh HSC.
Bidh IPA ag atharrachadh meud cealla agus iom-fhillteachd siotoplasmach ann an ceallan LX-2. Ìomhaighean riochdachail de mhion-sgrùdadh siotoplasmach sruthadh. Chleachd an anailis ro-innleachd geataidh sònraichte do cheallan LX-2: SSC-A/FSC-A gus àireamh-shluaigh nan ceallan a mhìneachadh, FSC-H/FSC-A gus dùblaidhean a chomharrachadh, agus SSC-H/FSC-H airson mion-sgrùdadh meud is iom-fhillteachd ceallan. Chaidh ceallan a ghoir le TGF-β1 (5 ng/ml) agus 1 mM IPA ann am meadhan gun serum airson 24 uair a thìde. Chaidh ceallan LX-2 a sgaoileadh anns a’ cheathramh chlì ìosal (SSC-H-/FSC-H-), a’ cheathramh chlì àrd (SSC-H+/FSC-H-), a’ cheathramh deas ìosal (SSC-H-/FSC-H+), agus a’ cheathramh deas àrd (SSC-H+/FSC-H+) airson mion-sgrùdadh meud cealla agus iom-fhillteachd siotoplasmach. B. Chaidh morf-eòlas nan ceallan a sgrùdadh le siotoplasmach sruthadh a’ cleachdadh FSC-H (sgaoileadh air adhart, meud cealla) agus SSC-H (sgaoileadh taobh, iom-fhillteachd siotoplasmach) (30,000 tachartas). Tha dàta air a thaisbeanadh mar chuibheasachd ± SD, n = 3 deuchainnean neo-eisimeileach. Chaidh coimeasan staitistigeil a dhèanamh a’ cleachdadh ANOVA aon-shligheach agus deuchainn iar-dhòs Bonferroni. *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001 agus ****p < 0.0001
Tha metabolites gut leithid IPA air a bhith nan cuspair teth rannsachaidh, a’ moladh gum faodadh targaidean ùra a bhith air an lorg ann am microbiota a’ ghut. Mar sin tha e inntinneach gu bheil IPA, metabolite a tha sinn air a cheangal ri fibrosis grùthan ann an daoine [15], air a shealltainn mar cho-thàthadh antifibrotic a dh’ fhaodadh a bhith ann ann am modalan bheathaichean [13, 14]. An seo, tha sinn a’ sealltainn airson a’ chiad uair ceangal eadar serum IPA agus transcriptomics grùthan cruinneil agus methylation DNA ann an daoine reamhar às aonais tinneas an t-siùcair seòrsa 2 (T2D), a’ soilleireachadh apoptosis, mitophagy agus fad-beatha, a bharrachd air gine tagraiche a dh’ fhaodadh a bhith ann AKT1 a bhios a’ riaghladh homeostasis grùthan. Is e rud ùr eile san sgrùdadh againn gun do sheall sinn an eadar-obrachadh eadar làimhseachadh IPA le apoptosis, morf-eòlas cealla, bith-lùth mitochondrial agus daineamaigs ann an ceallan LX-2, a’ nochdadh speactram lùtha nas ìsle a ghluaiseas an phenotype HSC a dh’ ionnsaigh neo-ghnìomhachd, a’ dèanamh IPA na thagraiche a dh’ fhaodadh a bhith ann airson fibrosis grùthan a leasachadh.
Fhuair sinn a-mach gur e apoptosis, mitophagy agus fad-beatha na slighean canònach as cudromaiche a bha beairteach ann an ginean grùthan co-cheangailte ri IPA serum a tha a’ cuairteachadh. Faodaidh briseadh air siostam smachd càileachd mitochondrial (MQC) leantainn gu mì-ghnìomhachd mitochondrial, mitophagy agus apoptosis, agus mar sin a’ brosnachadh tachairt MASLD [33, 34]. Mar sin, is urrainn dhuinn beachdachadh gum faodadh IPA a bhith an sàs ann a bhith a’ cumail suas daineamaigs cealla agus ionracas mitochondrial tro apoptosis, mitophagy agus fad-beatha san grùthan. Sheall an dàta againn gu robh dà ghine cumanta thar nan trì deuchainnean: YKT6 agus AKT1. Is fhiach a thoirt fa-near gur e pròtain SNARE a th’ ann an YKT6 a tha an sàs ann am pròiseas aonadh membran cealla. Tha pàirt aige ann an autophagy agus mitophagy le bhith a’ cruthachadh iom-fhillte tòiseachaidh le STX17 agus SNAP29 air an autophagosome, agus mar sin a’ brosnachadh aonadh autophagosomes agus lysosomes [35]. A bharrachd air sin, bidh call gnìomh YKT6 ag adhbhrachadh lagachadh ann am mitophagy[36], agus tha àrdachadh ann an YKT6 co-cheangailte ri adhartas carcinoma hepatocellular (HCC), a’ sealltainn barrachd mairsinneachd cealla[37]. Air an làimh eile, is e AKT1 an gine eadar-ghnìomhach as cudromaiche agus tha pàirt chudromach aige ann an galairean grùthan, a’ gabhail a-steach slighe chomharran PI3K/AKT, cearcall cealla, imrich cealla, iomadachadh, greamachadh fòcasach, gnìomh mitochondrial, agus secretion collagen[38–40]. Faodaidh slighe chomharran PI3K/AKT gnìomhaichte ceallan gas hematopoietic (HSCn) a ghnìomhachadh, is iad sin na ceallan a tha an urra ri cinneasachadh maitrís extracellular (ECM), agus faodaidh an dì-riaghladh aige cur ri tachairt agus adhartas fibrosis grùthan[40]. A bharrachd air an sin, tha AKT mar aon de na prìomh nithean mairsinneachd cealla a chuireas casg air apoptosis cealla an urra ri p53, agus faodaidh gnìomhachadh AKT a bhith co-cheangailte ri casg air apoptosis cealla grùthan[41, 42]. Tha na toraidhean a fhuaireadh a’ moladh gum faodadh IPA a bhith an sàs ann an apoptosis co-cheangailte ri mitochondria grùthan le bhith a’ toirt buaidh air co-dhùnadh hepatocytes eadar a dhol a-steach do apoptosis no mairsinn. Dh’fhaodadh na buaidhean seo a bhith air an riaghladh le ginean tagraiche AKT agus/no YKT6, a tha deatamach airson homeostasis an grùthan.
Sheall na toraidhean againn gun do bhrosnaich 1 mM IPA apoptosis agus gun do lughdaich e anail mitochondrial ann an ceallan LX-2 neo-eisimeileach bho làimhseachadh TGF-β1. Is fhiach a thoirt fa-near gur e apoptosis prìomh shlighe airson fuasgladh fibrosis agus gnìomhachadh ceallan gas hematopoietic (HSC), agus tha e cuideachd na thachartas cudromach ann am freagairt fiseòlasach reversible fibrosis grùthan [4, 43]. A bharrachd air an sin, thug ath-nuadhachadh BHI ann an ceallan LX-2 às deidh làimhseachadh measgaichte lèirsinn ùr air dreuchd a dh’ fhaodadh a bhith aig IPA ann an riaghladh bith-lùth mitochondrial. Fo chumhachan fois agus neo-ghnìomhach, mar as trice bidh ceallan hematopoietic a’ cleachdadh fosfaireachadh oxidative mitochondrial gus ATP a thoirt gu buil agus tha gnìomhachd metabolach ìosal aca. Air an làimh eile, bidh gnìomhachadh HSC a’ neartachadh anail mitochondrial agus biosynthesis gus dìoladh a dhèanamh airson iarrtasan lùtha a bhith a’ dol a-steach don staid glycolytic [44]. Tha an fhìrinn nach do chuir IPA buaidh air comas metabolach agus ECAR a’ moladh nach eil an t-slighe glycolytic cho cudromach. San aon dòigh, sheall sgrùdadh eile gun robh 1 mM IPA comasach air gnìomhachd slabhraidh analach mitochondrial a mhodachadh ann an cardiomyocytes, loidhne cealla hepatocyte daonna (Huh7) agus ceallan endothelial vein umbilical daonna (HUVEC); Ach, cha deach buaidh sam bith a lorg aig IPA air glycolysis ann an cardiomyocytes, a’ moladh gum faodadh IPA buaidh a thoirt air bith-lùth sheòrsachan cealla eile [45]. Mar sin, tha sinn a’ beachdachadh gum faodadh 1 mM IPA a bhith na dhì-cheangalaiche ceimigeach tlàth, leis gum faod e abairt gine fibrogenic, morf-eòlas cealla agus bith-lùth mitochondrial a lughdachadh gu mòr gun atharrachadh a dhèanamh air meud an mtDNA [46]. Faodaidh dì-cheanglaichean mitochondrial casg a chuir air fibrosis air adhbhrachadh le cultar agus gnìomhachadh HSC [47] agus cinneasachadh ATP mitochondrial a lughdachadh a tha air a riaghladh no air a bhrosnachadh le pròtainean sònraichte leithid pròtainean dì-cheangail (UCP) no adenine nucleotide translocase (ANT). A rèir an t-seòrsa cealla, faodaidh an iongantas seo ceallan a dhìon bho apoptosis agus / no apoptosis adhartachadh [46]. Ach, tha feum air tuilleadh sgrùdaidhean gus dreuchd IPA mar dhì-cheangalaiche mitochondrial ann an neo-ghnìomhachadh ceallan gas hematopoietic a shoilleireachadh.
An uairsin rinn sinn sgrùdadh a bheil na h-atharrachaidhean ann an anail mitochondrial air an nochdadh ann am morf-eòlas mitochondrial ann an ceallan LX-2 beò. Gu inntinneach, bidh làimhseachadh TGF-β1 ag atharrachadh co-roinn mitochondrial bho chruinneach gu meadhanach, le lùghdachadh ann am geugachadh mitochondrial agus barrachd abairt de DRP1, prìomh fhactar ann an sgaradh mitochondrial [48]. A bharrachd air an sin, tha briseadh mitochondrial co-cheangailte ri iom-fhillteachd lìonra iomlan, agus tha an gluasad bho aonadh gu sgaradh deatamach airson gnìomhachadh ceallan gas hematopoietic (HSC), ach tha casg air sgaradh mitochondrial ag adhbhrachadh apoptosis HSC [49]. Mar sin, tha na toraidhean againn a’ nochdadh gum faodadh làimhseachadh TGF-β1 lùghdachadh ann an iom-fhillteachd lìonra mitochondrial adhbhrachadh le lùghdachadh ann am geugachadh, a tha nas cumanta ann an sgaradh mitochondrial co-cheangailte ri ceallan gas hematopoietic gnìomhaichte (HSCn). A bharrachd air an sin, sheall an dàta againn gum faodadh IPA co-roinn mitochondria atharrachadh bho chumadh chruinneach gu meadhanach, agus mar sin a’ lughdachadh abairt OPA1 agus MFN2. Tha sgrùdaidhean air sealltainn gum faodadh lùghdachadh OPA1 lùghdachadh adhbhrachadh ann an comas membran mitochondrial agus apoptosis cealla a bhrosnachadh [50]. Tha fios gu bheil MFN2 a’ meadhanachadh aonadh mitochondrial agus apoptosis [51]. Tha na toraidhean a fhuaireadh a’ moladh gu bheil coltas gu bheil brosnachadh cheallan LX-2 le TGF-β1 agus/no IPA a’ toirt buaidh air cumadh is meud mitochondrial, a bharrachd air staid gnìomhachaidh agus iom-fhillteachd lìonra.
Tha na toraidhean againn a’ nochdadh gum faodadh làimhseachadh measgaichte TGFβ-1 agus IPA mtDNA agus paramadairean morf-eòlach cealla a lùghdachadh le bhith a’ riaghladh abairt mRNA de fibrosis, apoptosis agus ginean co-cheangailte ri mairsinn ann an ceallan a tha a’ seachnadh apoptosis. Gu dearbh, lughdaich IPA ìre abairt mRNA AKT1 agus ginean fibrosis cudromach leithid COL1A2 agus MMP2, ach mheudaich e ìre abairt CASP8, a tha co-cheangailte ri apoptosis. Sheall na toraidhean againn, às deidh làimhseachadh IPA, gun do lùghdaich abairt BAX agus gun do mheudaich abairt mRNA de fho-aonadan teaghlaich TIMP1, BCL-2 agus NF-κB, a’ moladh gum faodadh IPA comharran mairsinn a bhrosnachadh ann an ceallan gas hematopoietic (HSCn) a tha a’ seachnadh apoptosis. Faodaidh na moileciuilean sin a bhith nan comharran pro-mairsinn ann an ceallan gas hematopoietic gnìomhaichte, a dh’ fhaodadh a bhith co-cheangailte ri barrachd abairt de phròtainean anti-apoptotic (leithid Bcl-2), lùghdachadh abairt de BAX pro-apoptotic, agus eadar-chluich iom-fhillte eadar TIMP agus NF-κB [5, 7]. Bidh IPA a’ cur a bhuaidh an gnìomh tro PXR, agus fhuair sinn a-mach gun do mheudaich làimhseachadh measgaichte le TGF-β1 agus IPA ìrean abairt mRNA PXR, a’ nochdadh casg air gnìomhachd HSC. Tha fios gu bheil comharran PXR gnìomhaichte a’ cur bacadh air gnìomhachd HSC an dà chuid in vivo agus in vitro [52, 53]. Tha na toraidhean againn a’ nochdadh gum faodadh IPA pàirt a ghabhail ann a bhith a’ glanadh HSCn gnìomhaichte le bhith a’ brosnachadh apoptosis, a’ lughdachadh fibrosis agus metabolism mitochondrial, agus a’ neartachadh comharran mairsinn, a tha nan pròiseasan àbhaisteach a bhios ag atharrachadh an phenotype HSC gnìomhaichte gu fear neo-ghnìomhach. Mìneachadh eile a dh’ fhaodadh a bhith ann airson an dòigh-obrach agus an dreuchd a dh’ fhaodadh a bhith aig IPA ann an apoptosis is e gu bheil e a’ sgrìobadh mitochondria mì-ghnìomhach sa mhòr-chuid tro mitophagy (slighe intrinsic) agus an t-slighe comharran TNF extrinsic (Clàr 1), a tha ceangailte gu dìreach ris an t-slighe comharran mairsinn NF-κB (Figear a bharrachd 7). Gu inntinneach, tha ginean beairteach co-cheangailte ri IPA comasach air comharran pro-apoptotic agus pro-mairsinn a bhrosnachadh anns an t-slighe apoptotic [54], a’ moladh gum faodadh IPA an t-slighe apoptotic no mairsinn a bhrosnachadh le bhith ag eadar-obrachadh leis na ginean sin. Ach, chan eil e soilleir fhathast ciamar a bhios IPA ag adhbhrachadh apoptosis no mairsinn beò rè gnìomhachadh HSC agus na slighean meacanaigeach aige.
'S e metabolite meanbh-fhàs-bheairtean a th' ann an IPA a tha air a chruthachadh bho tryptophan daithead tro mhicrobiota a' ghut. Tha sgrùdaidhean air sealltainn gu bheil feartan anti-inflammatory, antioxidant, agus riaghlaidh epigenetic aige anns an àrainneachd intestinal.[55] Tha sgrùdaidhean air sealltainn gun urrainn dha IPA gnìomh bacadh intestinal atharrachadh agus cuideam oxidative a lughdachadh, a dh'fhaodadh cur ri na buaidhean fiseòlasach ionadail aige.[56] Gu dearbh, tha IPA air a ghiùlan gu buill-bodhaig targaid tron ​​​​​​chuairteachadh, agus leis gu bheil structar metabolite mòr coltach ri tryptophan, serotonin, agus toraidhean indole aig IPA, bidh IPA a’ cur an gnìomh gnìomhan metabolach a’ leantainn gu cinn-uidhe metabolach farpaiseach.[52] Dh’ fhaodadh IPA farpais ri metabolites a thig bho tryptophan airson làraichean ceangail air enzyman no gabhadan, a dh’ fhaodadh slighean metabolach àbhaisteach a chuir às a chèile. Tha seo a’ soilleireachadh an fheum air tuilleadh sgrùdaidhean air a pharmacodynamics agus pharmacodynamics gus tuigse nas fheàrr fhaighinn air an uinneag leigheasach aige.[57] Tha e fhathast ri fhaicinn an urrainn dha seo tachairt ann an ceallan gas hematopoietic (HSCn) cuideachd.
Tha sinn ag aithneachadh gu bheil cuid de chuingealachaidhean aig an sgrùdadh againn. Gus sgrùdadh sònraichte a dhèanamh air ceanglaichean co-cheangailte ri IPA, chuir sinn às do dh’euslaintich le tinneas an t-siùcair seòrsa 2 (T2DM). Tha sinn ag aithneachadh gu bheil seo a’ cuingealachadh cho farsaing sa tha na co-dhùnaidhean againn iomchaidh do dh’euslaintich le tinneas an t-siùcair seòrsa 2 agus galar grùthan adhartach. Ged a tha an dùmhlachd fiseòlasach de IPA ann an serum daonna 1–10 μM [11, 20], chaidh dùmhlachd de 1 mM IPA a thaghadh stèidhichte air an dùmhlachd neo-phuinnseanta as àirde [15] agus an ìre as àirde de apoptosis, gun eadar-dhealachadh sam bith ann an ceudad sluagh nan ceallan necrotic. Ged a chaidh ìrean supraphysiological de IPA a chleachdadh san sgrùdadh seo, chan eil co-aontachd ann an-dràsta a thaobh an dòs èifeachdach de IPA [52]. Ged a tha na toraidhean againn cudromach, tha dàn metabolach nas fharsainge IPA fhathast na raon rannsachaidh gnìomhach. A bharrachd air an sin, fhuaireadh na co-dhùnaidhean againn air a’ cheangal eadar ìrean IPA serum agus methylation DNA de thar-sgrìobhaidhean grùthan chan ann a-mhàin bho cheallan gas hematopoietic (HSCn) ach cuideachd bho fhigheagan grùthan. Thagh sinn ceallan LX-2 daonna a chleachdadh stèidhichte air na co-dhùnaidhean a rinn sinn roimhe bho mhion-sgrùdadh transcriptome gu bheil IPA co-cheangailte ri gnìomhachadh ceallan gas hematopoietic (HSC) [15], agus gur iad HSCn na prìomh cheallan a tha an sàs ann an adhartas fibrosis an grùthan. Tha an grùthan air a dhèanamh suas de iomadh seòrsa cealla, agus mar sin bu chòir beachdachadh air modalan cealla eile leithid siostam co-chultar hepatocyte-HSC-cealla dìonachd còmhla ri gnìomhachadh caspase agus briseadh DNA a bharrachd air an dòigh-obrach gnìomh a’ gabhail a-steach ìre pròtain gus sgrùdadh a dhèanamh air dreuchd IPA agus an eadar-obrachadh aige le seòrsachan cealla grùthan eile.