Tha an t-artaigil mar phàirt den chuspair rannsachaidh “A’ leasachadh strì an aghaidh lus-phònairean ri pathogens agus plàighean”, faic na 5 artaigilean uile.
Tha an t-àidseant a tha ag adhbhrachadh necrosis a’ ghalair fungach planntrais Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary a’ cleachdadh ro-innleachd ioma-ìre gus diofar lusan aoigheachd a ghlacadh. Tha an sgrùdadh seo a’ moladh cleachdadh an diamine L-ornithine, amino-aigéad neo-phròtain a bhios a’ brosnachadh co-chur amino-aigéid riatanach eile, mar ro-innleachd riaghlaidh eile gus freagairtean moileciuil, fiseòlasach agus bith-cheimiceach Phaseolus vulgaris L. a neartachadh ri moll geal air adhbhrachadh le Pseudomonas sclerotiorum. Sheall deuchainnean in vitro gun do chuir L-ornithine bacadh mòr air fàs mycelial S. pyrenoidosa ann an dòigh a bha an urra ris an dòs. A bharrachd air an sin, dh’ fhaodadh e cho dona sa tha moll geal a lughdachadh gu mòr fo chumhachan taigh-glainne. A bharrachd air an sin, bhrosnaich L-ornithine fàs nan lusan a chaidh a làimhseachadh, a’ nochdadh nach robh na dùmhlachdan deuchainn de L-ornithine phytotoxic dha na lusan a chaidh a làimhseachadh. A bharrachd air sin, mheudaich L-ornithine abairteachadh antioxidants neo-ensaimeach (phenolics agus flavonoids soluble iomlan) agus antioxidants einsaimeach (catalase (CAT), peroxidase (POX), agus polyphenol oxidase (PPO)), agus mheudaich e abairteachadh trì ginean co-cheangailte ri antioxidants (PvCAT1, PvSOD, agus PvGR). A bharrachd air an sin, nochd mion-sgrùdadh in silico gu robh pròtain oxaloacetate acetylhydrolase (SsOAH) a dh’fhaodadh a bhith ann anns a’ ghineam S. sclerotiorum, a bha glè choltach ris na pròtainean oxaloacetate acetylhydrolase (SsOAH) de Aspergillus fijiensis (AfOAH) agus Penicillium sp. (PlOAH) a thaobh mion-sgrùdadh gnìomh, raointean glèidhte, agus topology. Gu inntinneach, lùghdaich cur L-ornithine ri meadhan broth dextrose buntàta (PDB) abairteachadh a’ ghine SsOAH ann am mycelia S. sclerotiorum gu mòr. San aon dòigh, lùghdaich cleachdadh L-ornithine bhon taobh a-muigh gu mòr abairt a’ ghine SsOAH ann am mycelia fungach a chaidh a chruinneachadh bho lusan air an làimhseachadh. Mu dheireadh, lùghdaich cleachdadh L-ornithine gu mòr secretion searbhag oxalic an dà chuid ann am meadhan PDB agus duilleagan gabhaltach. Mar cho-dhùnadh, tha pàirt chudromach aig L-ornithine ann a bhith a’ cumail suas inbhe redox a bharrachd air a bhith a’ neartachadh freagairt dìon lusan gabhaltach. Dh’ fhaodadh toraidhean an sgrùdaidh seo cuideachadh le bhith a’ leasachadh dhòighean ùr-ghnàthach, càirdeil don àrainneachd gus smachd a chumail air molltair geal agus a bhuaidh air cinneasachadh pònairean agus bàrr eile a lughdachadh.
Tha moll geal, air adhbhrachadh leis an fhungas necrotrofach Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary, na ghalar millteach, a lùghdaicheas toradh agus a tha a’ bagairt gu mòr air cinneasachadh pònairean (Phaseolus vulgaris L.) air feadh an t-saoghail (Bolton et al., 2006). Tha Sclerotinia sclerotiorum mar aon de na pathogens planntrais fungach as duilghe a smachdachadh a tha air an giùlan san ùir, le raon farsaing de chòrr air 600 gnè planntrais agus a’ chomas clò aoigheachd a mhacarachadh gu luath ann an dòigh neo-shònraichte (Liang agus Rollins, 2018). Fo chumhachan mì-fhàbharach, bidh e a’ dol tro ìre chudromach de a chearcall-beatha, a’ fuireach na chadal airson ùine mhòr mar structaran dubha, cruaidh, coltach ri sìol ris an canar ‘sclerotia’ san ùir no mar fhàsan geala, siùbhlach ann am mycelium no gas lusan gabhaltach (Schwartz et al., 2005). Tha S. sclerotiorum comasach air sclerotia a chruthachadh, a leigeas leis a bhith beò ann an achaidhean gabhaltach airson ùine mhòr agus mairsinn rè galair (Schwartz et al., 2005). Tha sclerotia beairteach ann am beathachadh, faodaidh iad mairsinn san ùir airson ùine mhòr, agus bidh iad nan inoculum bunasach airson galairean às dèidh sin (Schwartz et al., 2005). Fo chumhachan fàbharach, bidh sclerotia a’ germachadh agus a’ toirt a-mach spòran èadhair as urrainn a h-uile pàirt os cionn na talmhainn den lus a ghlacadh, a’ gabhail a-steach ach gun a bhith cuibhrichte gu flùraichean, gasan, no pods (Schwartz et al., 2005).
Bidh Sclerotinia sclerotiorum a’ cleachdadh ro-innleachd ioma-ìre gus na lusan aoigheachd aige a ghlacadh, anns a bheil sreath de thachartasan co-òrdanaichte bho ghineadh sclerotial gu leasachadh chomharran. An toiseach, bidh S. sclerotiorum a’ dèanamh spòran crochte (ris an canar ascospores) bho structaran coltach ri balgan-buachair ris an canar apothecia, a bhios a’ fàs san adhar agus a’ leasachadh gu bhith nan sclerotia neo-ghluasadach air sprùilleach planntrais air a bheil galar (Bolton et al., 2006). An uairsin bidh am fungas a’ leigeil a-mach searbhag oxalic, factar puinnseanta, gus smachd a chumail air pH balla cealla planntrais, lughdachadh enzymatic agus ionnsaigh clò a bhrosnachadh (Hegedus agus Rimmer, 2005), agus casg a chuir air spreadhadh oxidative a’ phlannt aoigheachd. Bidh am pròiseas searbhachaidh seo a’ lagachadh balla cealla a’ phlanntrais, a’ toirt seachad àrainneachd fàbharach airson obrachadh àbhaisteach agus èifeachdach enzyman a tha a’ lughdachadh balla cealla fungach (CWDEs), a’ leigeil leis a’ phataigin faighinn thairis air a’ bhacadh corporra agus a dhol a-steach do fhigheagan an aoigheachd (Marciano et al., 1983). Aon uair ‘s gu bheil e air a dhol a-steach, bidh S. sclerotiorum a’ leigeil a-mach grunn CWDEn, leithid polygalacturonase agus cellulase, a bhios a’ comasachadh a sgaoileadh ann an clòthan gabhaltach agus ag adhbhrachadh necrosis clò. Bidh adhartas lotan agus mataichean hyphal ag adhbhrachadh nan comharran sònraichte de mholl geal (Hegedus agus Rimmer, 2005). Aig an aon àm, bidh lusan aoigheachd ag aithneachadh phàtranan moileciuil co-cheangailte ri pathogens (PAMPs) tro gabhadan aithneachadh phàtran (PRRs), a’ piobrachadh sreath de thachartasan comharran a bhios mu dheireadh a’ gnìomhachadh freagairtean dìon.
A dh’aindeoin deicheadan de dh’oidhirpean smachd a chumail air galairean, tha gainnead de ghineamaigs sheasmhach gu leòr ann am pònairean, mar ann am bàrr malairteach eile, air sgàth strì an aghaidh galairean, mairsinneachd agus comas atharrachadh a’ phataigin. Mar sin, tha riaghladh galairean gu math dùbhlanach agus feumaidh e ro-innleachd aonaichte, ioma-thaobhach anns a bheil measgachadh de chleachdaidhean cultarail, smachd bith-eòlasach agus fungais-mharbhaichean ceimigeach (O'Sullivan et al., 2021). Is e smachd ceimigeach air molltair geal an fheadhainn as èifeachdaiche oir faodaidh fungais-mharbhaichean, nuair a thèid an cur an sàs gu ceart agus aig an àm cheart, sgaoileadh a’ ghalair a smachdachadh gu h-èifeachdach, cho dona ‘s a tha an galar a lughdachadh agus call toraidh a lughdachadh. Ach, faodaidh cus cleachdadh agus cus earbsa ann am fungais-mharbhaichean leantainn gu nochdadh sreathan sheasmhach de S. sclerotiorum agus droch bhuaidh a thoirt air fàs-bheairtean nach eil nan targaid, slàinte na h-ùire agus càileachd uisge (Le Cointe et al., 2016; Ceresini et al., 2024). Mar sin, tha lorg roghainnean eile a tha càirdeil don àrainneachd air a bhith na phrìomhachas.
Faodaidh polyamines (PAs), leithid putrescine, spermidine, spermine, agus cadaverine, a bhith nan roghainnean gealltanach an aghaidh pathogens planntrais a tha air an giùlan san ùir, agus mar sin a’ lughdachadh gu tur no ann am pàirt cleachdadh fungicides ceimigeach cunnartach (Nehela et al., 2024; Yi et al., 2024). Ann an lusan nas àirde, tha PAs an sàs ann am mòran phròiseasan fiseòlasach a’ gabhail a-steach, ach gun a bhith cuibhrichte gu, roinneadh cealla, eadar-dhealachadh, agus freagairt do chuideaman neo-bhitheach agus bith-eòlasach (Killiny agus Nehela, 2020). Faodaidh iad a bhith nan antioxidants, cuideachadh le bhith a’ glacadh gnèithean ocsaidean ath-ghnìomhach (ROS), a’ cumail suas homeostasis redox (Nehela agus Killiny, 2023), a’ brosnachadh ginean co-cheangailte ri dìon (Romero et al., 2018), a’ riaghladh diofar shlighean metabolach (Nehela agus Killiny, 2023), a’ modúlachadh phytohormones endogenous (Nehela agus Killiny, 2019), a’ stèidheachadh strì an aghaidh galairean siostamach (SAR), agus a’ riaghladh eadar-obrachadh planntrais-pathogen (Nehela agus Killiny, 2020; Asija et al., 2022; Czerwoniec, 2022). Is fhiach a thoirt fa-near gu bheil na dòighean-obrach agus na dreuchdan sònraichte aig PAn ann an dìon planntrais ag atharrachadh a rèir gnèithean planntrais, pathogens, agus suidheachaidhean àrainneachdail. Tha am PA as pailte ann an lusan air a bhith air a biosynthesize bhon polyamine riatanach L-ornithine (Killiny agus Nehela, 2020).
Tha iomadh dreuchd aig L-ornithine ann am fàs is leasachadh lusan. Mar eisimpleir, tha sgrùdaidhean roimhe air sealltainn, ann an rus (Oryza sativa), gum faodadh ornithine a bhith co-cheangailte ri ath-chuairteachadh naitridean (Liu et al., 2018), toradh rus, càileachd is fàileadh (Lu et al., 2020), agus freagairt ri cuideam uisge (Yang et al., 2000). A bharrachd air an sin, mheudaich cleachdadh L-ornithine bho thaobh a-muigh fulangas tart ann am biatas siùcair (Beta vulgaris) (Hussein et al., 2019) gu mòr agus lughdaich e cuideam salainn ann an lusan oinniún (Allium Cepa) (Çavuşoǧlu agus Çavuşoǧlu, 2021) agus cnòthan-càise (Anacardium occidentale) (da Rocha et al., 2012). Is dòcha gu bheil dreuchd a dh’ fhaodadh a bhith aig L-ornithine ann an dìon an aghaidh cuideam neo-bhitheach mar thoradh air a bhith an sàs ann an cruinneachadh proline ann an lusan air an làimhseachadh. Mar eisimpleir, chaidh aithris roimhe seo gu bheil ginean co-cheangailte ri metabolism proline, leithid ginean ornithine delta aminotransferase (delta-OAT) agus proline dehydrogenase (ProDH1 agus ProDH2), an sàs ann an dìon Nicotiana benthamiana agus Arabidopsis thaliana an aghaidh sreathan Pseudomonas syringae nach eil san aoigh (Senthil-Kumar agus Mysore, 2012). Air an làimh eile, tha feum air ornithine decarboxylase fungach (ODC) airson fàs pathogens (Singh et al., 2020). Le bhith a’ targaideadh ODC de Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici tro bhith a’ cur às do ghinean air adhbhrachadh leis an aoigh (HIGS) mheudaich sin gu mòr strì lusan tomato ri Fusarium wilting (Singh et al., 2020). Ach, chan eil an dreuchd a dh’ fhaodadh a bhith aig cleachdadh ornithine exogenous an aghaidh cuideaman bith-eòlasach leithid phytopathogens air a sgrùdadh gu math. Nas cudromaiche, chan eil mòran rannsachaidh fhathast air buaidh ornithine air strì an aghaidh ghalaran agus na h-iomadh rud bith-cheimiceach agus fiseòlasach co-cheangailte ris.
Tha e cudromach tuigse fhaighinn air cho iom-fhillte ‘s a tha galair S. sclerotiorum ann an leaghan airson ro-innleachdan smachd èifeachdach a leasachadh. Anns an sgrùdadh seo, bha sinn ag amas air dreuchd a dh’ fhaodadh a bhith aig an diamine L-ornithine a chomharrachadh mar phrìomh fheart ann a bhith a’ neartachadh uidheaman dìon agus strì lusan leaghan an aghaidh galair Sclerotinia sclerotiorum. Tha sinn a’ smaoineachadh, a bharrachd air a bhith a’ neartachadh freagairtean dìon lusan gabhaltach, gu bheil pàirt chudromach aig L-ornithine cuideachd ann a bhith a’ cumail suas inbhe redox. Tha sinn a’ moladh gu bheil na buaidhean a dh’ fhaodadh a bhith aig L-ornithine co-cheangailte ri riaghladh uidheaman dìon antioxidant enzymatic agus neo-enzymic agus bacadh air factaran pathogenity / virulence fungach agus pròtainean co-cheangailte. Tha an dà-ghnìomhachd seo aig L-ornithine ga dhèanamh na thagraiche gealltanach airson ro-innleachd sheasmhach gus buaidh molltair geal a lughdachadh agus strì bàrr leaghan cumanta an aghaidh a’ phataigin fungach chumhachdaich seo a neartachadh. Faodaidh toraidhean an sgrùdaidh seo cuideachadh le bhith a’ leasachadh dhòighean ùr-ghnàthach, càirdeil don àrainneachd gus smachd a chumail air molltair geal agus a bhuaidh air cinneasachadh leaghan a lughdachadh.
Anns an sgrùdadh seo, chaidh seòrsa malairteach so-leònte de phònaire cumanta, Giza 3 (Phaseolus vulgaris L. cv. Giza 3), a chleachdadh mar stuth deuchainneach. Chaidh sìol fallain a thoirt seachad gu coibhneil le Roinn Rannsachaidh Legume, Institiud Rannsachaidh Bhàrr Achaidh (FCRI), Ionad Rannsachaidh Àiteachais (ARC), an Èiphit. Chaidh còig sìol a chur ann am poitean plastaig (trast-thomhas a-staigh 35 cm, doimhneachd 50 cm) air an lìonadh le ùir air a bheil S. sclerotiorum fo chumhachan taigh-glainne (25 ± 2 °C, taiseachd coimeasach 75 ± 1%, 8 uairean solais / 16 uairean dorchadas). Aig 7–10 latha an dèidh cur (DPS), chaidh na sìol-chraobhan a tanachadh gus dìreach dà shìol-chraobh fhàgail le fàs cunbhalach agus trì duilleagan làn-leudaichte anns gach poit. Chaidh uisge a thoirt do na lusan poite uile aon uair gach dà sheachdain agus chaidh an todhar a thoirt dhaibh gach mìos aig an ìre a thathar a’ moladh airson an t-seòrsa sònraichte.
Gus dùmhlachd 500 mg/L de L-ornithinediamine (ris an canar cuideachd searbhag (+)-(S)-2,5-diaminopentanoic; Sigma-Aldrich, Darmstadt, a' Ghearmailt) ullachadh, chaidh 50 mg a sgaoileadh an toiseach ann an 100 mL de dh'uisge grùide sterile. Chaidh am fuasgladh stoc an uairsin a lagachadh agus a chleachdadh ann an deuchainnean às dèidh sin. Gu h-aithghearr, chaidh sia sreathan de dhùmhlachdan L-ornithine (12.5, 25, 50, 75, 100, agus 125 mg/L) a dhearbhadh in vitro. A bharrachd air an sin, chaidh uisge grùide sterile a chleachdadh mar smachd àicheil (Mock) agus chaidh am fungas-dìon malairteach “Rizolex-T” 50% pùdar fliuch (toclofos-methyl 20% + thiram 30%; KZ-Kafr El Zayat Pesticides and Chemicals Company, Kafr El Zayat, Gharbia Governorate, an Èiphit) a chleachdadh mar smachd deimhinneach. Chaidh an luibh-fhungais malairteach “Rizolex-T” a dhearbhadh in vitro aig còig dùmhlachdan (2, 4, 6, 8 agus 10 mg/L).
Chaidh sampallan de ghasan is pods pònairean cumanta a’ sealltainn comharran àbhaisteach molltair gheal (ìre plàighean: 10–30%) a chruinneachadh bho thuathanasan malairteach. Ged a chaidh a’ mhòr-chuid de na stuthan planntrais air an robh galair a chomharrachadh a rèir gnè/seòrsa (seòrsa malairteach so-leònte Giza 3), bha cuid eile, gu sònraichte an fheadhainn a fhuaireadh bho mhargaidhean ionadail, de ghnèithean neo-aithnichte. Chaidh uachdar nan stuthan air an robh galair a chaidh a chruinneachadh a dhì-ghalarachadh an toiseach le fuasgladh sodium hypochlorite 0.5% airson 3 mionaidean, an uairsin an sruthladh grunn thursan le uisge grùide sterile agus an tiormachadh le pàipear sìoltachain sterile gus cus uisge a thoirt air falbh. Chaidh na buill-bodhaig air an robh galair an uairsin a ghearradh ann am pìosan beaga bhon fhighe mheadhanach (eadar fhigheagan fallain agus air an galarachadh), an àiteachadh air meadhan agar dextrose buntàta (PDA) agus an goir aig 25 ± 2 °C le cearcall solais 12 uair / dorchadas 12 uair airson 5 latha gus cruthachadh sclerotia a bhrosnachadh. Chaidh an dòigh mycelial tip a chleachdadh cuideachd gus fungasan a ghlanadh bho chultaran measgaichte no air an truailleadh. Chaidh an fungas air a ghlanadh a chomharrachadh an toiseach stèidhichte air na feartan morf-eòlach cultarail aige agus an uairsin chaidh a dhearbhadh gur e S. sclerotiorum a bh’ ann stèidhichte air feartan microscopach. Mu dheireadh, chaidh a h-uile isolat glan a dhearbhadh airson pathogenicachd air an cultivar pònaire cumanta so-leònte Giza 3 gus coinneachadh ri riatanasan Koch.
A bharrachd air an sin, chaidh an S. sclerotiorum isolate as ionnsaigheach (isolate #3) a dhearbhadh tuilleadh stèidhichte air sreath-sgrùdadh spacer tar-sgrìobhte a-staigh (ITS) mar a chaidh a mhìneachadh le White et al., 1990; Baturo-Ciesniewska et al., 2017. Gu h-aithghearr, chaidh isolates a fhàs ann am broth dextrose buntàta (PDB) agus a ghoir aig 25 ± 2 °C airson 5–7 latha. An uairsin chaidh mycelium fungach a chruinneachadh, a shìoladh tro chlò-chàise, a nighe dà uair le uisge sterile, agus a thiormachadh le pàipear sìoltachain sterile. Chaidh DNA genomic a sgaradh a’ cleachdadh an Quick-DNA™ Fungal/Bacterial Miniprep Kit (Kuramae-Izioka, 1997; Atallah et al., 2022, 2024). Chaidh roinn rDNA ITS an uair sin a mheudachadh le bhith a’ cleachdadh a’ phàir phrìmear ​​shònraichte ITS1/ITS4 (TCCGTAGGTGAACCTGCGG TCCTCCGCTTATTGATATGC; meud ris a bheil dùil: 540 bp) (Baturo-Ciesniewska et al., 2017). Chaidh na toraidhean PCR glanaidh a chur a-steach airson sreath-sgrùdadh (Beijing Aoke Dingsheng Biotechnology Co., Ltd.). Chaidh sreathan rDNA ITS a shreath-sgrùdadh gu dà-shligheach le bhith a’ cleachdadh dòigh sreath-sgrùdadh Sanger. Chaidh na sreathan ceiste a chaidh a chruinneachadh an uair sin a choimeas ris an dàta as ùire ann an GenBank agus an National Center for Biotechnology Information (NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/) a’ cleachdadh bathar-bog BLASTn. Chaidh an sreath ceiste a choimeas ri 20 seòrsa/eisimpleir eile de S. sclerotiorum a chaidh fhaighinn bhon dàta as ùire ann an NCBI GenBank (Clàr a bharrachd S1) a’ cleachdadh ClustalW anns a’ phasgan mion-sgrùdaidh gintinneachd mean-fhàsach molecular (MEGA-11; dreach 11) (Kumar et al., 2024). Chaidh mion-sgrùdadh mean-fhàsach a dhèanamh a’ cleachdadh an dòigh-obrach coltachd as motha agus am modail coitcheann ath-thionndaidheach ùine-ùine (Nei agus Kumar, 2000). Tha a’ chraobh leis an coltachd log as àirde air a sealltainn. Tha a’ chraobh thùsail airson an rannsachaidh heuristic air a taghadh le bhith a’ taghadh a’ chraobh leis an coltachd log as àirde eadar a’ chraobh nàbaidh-choimhearsnaich (NJ) (Kumar et al., 2024) agus a’ chraobh parsimony as motha (MP). Chaidh craobh NJ a thogail a’ cleachdadh maitrís astar paidhir air a thomhas a’ cleachdadh a’ mhodail choitcheann ath-thionndaidheach ùine (Nei agus Kumar, 2000).
Chaidh gnìomhachd antibacterial L-ornithine agus an bactericide “Rizolex-T” a dhearbhadh in vitro leis an dòigh sgaoilidh agar. Modh: Gabh an ìre iomchaidh den fhuasgladh stoc de L-ornithine (500 mg/L) agus measgaich e gu mionaideach le 10 ml de mheadhan beathachaidh PDA gus fuasglaidhean ullachadh le dùmhlachdan deireannach de 12.5, 25, 50, 75, 100 agus 125 mg/L, fa leth. Chaidh còig dùmhlachdan den fhungas-leigheis “Rizolex-T” (2, 4, 6, 8 agus 10 mg/L) agus uisge grùide sterile a chleachdadh mar smachd. Às deidh don mheadhan cruadhachadh, chaidh pluga mycelium ùr-ullaichte de chultar Sclerotinia sclerotiorum, 4 mm ann an trast-thomhas, a ghluasad gu meadhan a’ mhias Petri agus a chur air àiteach aig 25±2°C gus an do chòmhdaich am mycelium am mias Petri smachd gu lèir, agus às deidh sin chaidh fàs na fungas a chlàradh. Obraich a-mach an ceudad casg air fàs radaigeach S. sclerotiorum a’ cleachdadh co-aontar 1:
Chaidh an deuchainn ath-aithris dà uair, le sia ath-aithrisean bith-eòlasach airson gach buidheann smachd/deuchainneach agus còig poitean (dà lus gach poit) airson gach ath-aithris bith-eòlasach. Chaidh gach ath-aithris bith-eòlasach a sgrùdadh dà uair (dà ath-aithris theicnigeach) gus dèanamh cinnteach à cruinneas, earbsachd agus ath-riochdachadh nan toraidhean deuchainneach. A bharrachd air an sin, chaidh mion-sgrùdadh ath-tharraing probit a chleachdadh gus an dùmhlachd bacaidh leth-as àirde (IC50) agus IC99 obrachadh a-mach (Prentice, 1976).
Gus comas L-ornithine a mheasadh fo chumhachan taigh-glainne, chaidh dà dheuchainn phoit às dèidh a chèile a dhèanamh. Gu h-aithghearr, chaidh poitean a lìonadh le ùir crèadha-gainmhich sterilichte (3:1) agus chaidh cultar ùr-ullaichte de S. sclerotiorum a chur annta. An toiseach, chaidh an sgaradh as ionnsaigheach de S. sclerotiorum (sgaradh #3) a fhàs le bhith a’ gearradh aon sclerotium ann an leth, ga chur aghaidh sìos air PDA agus ga ghoir aig 25°C ann an dorchadas cunbhalach (24 uair) airson 4 latha gus fàs mycelium a bhrosnachadh. An uairsin chaidh ceithir plugaichean agar 5 mm ann an trast-thomhas a thoirt bhon oir stiùiridh agus chaidh 100 g de mheasgachadh steril de chruithneachd agus bran rus (1:1, v/v) a chur annta agus chaidh na flasgaichean uile a ghoir aig 25 ± 2 °C fo chearcall solais 12 uair / dorchadas 12 uair airson 5 latha gus cruthachadh sclerotia a bhrosnachadh. Chaidh susbaint nan flasgaichean uile a mheasgachadh gu mionaideach gus dèanamh cinnteach à aon-ghnèitheachd mus deach ùir a chur ris. An uair sin, chaidh 100g den mheasgachadh bran a bha a’ tuineachadh a chur ri gach poit gus dèanamh cinnteach gu robh dùmhlachd cunbhalach de phataigin ann. Chaidh na poitean air an robh an ion-stealladh uisgeachadh gus fàs fungas a bhrosnachadh agus an cur ann an suidheachaidhean taigh-glainne airson 7 latha.
Chaidh còig sìol den ghnè Giza 3 an uair sin a chur anns gach poit. Airson nam poitean a chaidh a làimhseachadh le L-ornithine agus am fungas-leigheis Rizolex-T, chaidh na sìol sterilichte a bogadh an toiseach airson dà uair a thìde ann am fuasgladh uisgeach den dà cho-thàthadh le dùmhlachd IC99 mu dheireadh de mu 250 mg/L agus 50 mg/L, fa leth, agus an uairsin an tiormachadh san adhar airson uair a thìde mus deach an cur. Air an làimh eile, chaidh na sìol a bogadh ann an uisge grùide steril mar smachd àicheil. Às dèidh 10 latha, mus deach an t-uisgeachadh an toiseach, chaidh na sìol-chraobhan a tanachadh, a’ fàgail dìreach dà shìol-chraobh glan anns gach poit. A bharrachd air an sin, gus dèanamh cinnteach à galar le S. sclerotiorum, chaidh gasan planntrais pònairean aig an aon ìre leasachaidh (10 latha) a ghearradh aig dà àite eadar-dhealaichte a’ cleachdadh scalpel sterilichte agus chaidh timcheall air 0.5 g den mheasgachadh bran tuineachaidh a chuir anns gach lot, agus an uairsin taiseachd àrd gus leasachadh galair is galair a bhrosnachadh anns a h-uile lus a chaidh a chonnadh. Chaidh planntaichean smachd a leòn san aon dòigh agus chaidh an aon mheud (0.5 g) de mheasgachadh bran sterile, neo-choloinichte a chur anns an lot agus a chumail fo taiseachd àrd gus an àrainneachd airson leasachadh galair ath-chruthachadh agus gus dèanamh cinnteach à cunbhalachd eadar buidhnean làimhseachaidh.
Modh làimhseachaidh: Chaidh sìol-chraobhan pònairean uisgeachadh le 500 ml de fhuasgladh uisgeach de L-ornithine (250 mg/l) no am fungas-leighis Rizolex-T (50 mg/l) le bhith a’ uisgeachadh na h-ùire, agus an uairsin chaidh an làimhseachadh ath-aithris trì tursan aig eadar-ama de 10 latha. Chaidh na smachdan a fhuair làimhseachadh placebo uisgeachadh le 500 ml de dh’uisge grùide sterile. Chaidh a h-uile làimhseachadh a dhèanamh fo chumhachan taigh-glainne (25 ± 2°C, 75 ± 1% taiseachd coimeasach, agus ùine-solais de 8 uairean solais / 16 uairean dorchadas). Chaidh a h-uile poit uisgeachadh gach dà sheachdain agus chaidh a làimhseachadh gach mìos le todhar NPK cothromach (20-20-20, le 3.6% sulfar agus meanbh-eileamaidean TE; Zain Seeds, an Èiphit) aig dùmhlachd de 3–4 g/l le bhith a’ frasadh duilleach a rèir nam molaidhean airson an t-seòrsa sònraichte agus stiùiridhean an neach-dèanamh. Mura h-eilear ag ràdh a chaisead, chaidh duilleagan làn-leudaichte (2na agus 3mh duilleag bhon mhullach) a chruinneachadh bho gach mac-samhail bith-eòlasach 72 uair an dèidh làimhseachaidh (hpt), an co-dhèanamh, an cruinneachadh agus an stòradh aig -80 °C airson tuilleadh mhion-sgrùdaidhean a’ gabhail a-steach, ach gun a bhith cuibhrichte gu, suidheachadh histochemical in situ de chomharran cuideam oxidative, peroxidation lipid, antioxidants enzymatic agus neo-ensímach agus abairt gine.
Chaidh dian gabhaltachd molltair gheal a mheasadh gach seachdain 21 latha às dèidh an in-stealladh (dpi) a’ cleachdadh sgèile 1–9 (Clàr a bharrachd S2) stèidhichte air sgèile Petzoldt agus Dickson (1996) air atharrachadh le Teran et al. (2006). Gu h-aithghearr, chaidh gasan is geugan lusan pònairean a sgrùdadh a’ tòiseachadh aig a’ phuing in-stealladh gus leantainn air adhartas nan lotan air feadh internodes agus nodan. Chaidh astar an lot bhon phuing in-stealladh chun a’ phuing as fhaide air feadh an gas no a’ mheur a thomhas an uairsin agus chaidh sgòr de 1–9 a thoirt seachad stèidhichte air àite an lot, far an robh (1) a’ comharrachadh nach robh galar ri fhaicinn faisg air a’ phuing in-stealladh agus (2–9) a’ comharrachadh àrdachadh mean air mhean ann am meud agus adhartas lotan air feadh nodan/internodes (Clàr a bharrachd S2). Chaidh dian gabhaltachd molltair gheal an uairsin a thionndadh gu ceudad a’ cleachdadh foirmle 2:
A bharrachd air sin, chaidh an raon fo lùb adhartais a’ ghalair (AUDPC) obrachadh a-mach a’ cleachdadh na foirmle (Shaner agus Finney, 1977), a chaidh atharrachadh o chionn ghoirid airson lobhadh geal pònairean cumanta (Chauhan et al., 2020) a’ cleachdadh co-aontar 3:
Far a bheil Yi = dèinead a’ ghalair aig àm ti, Yi+1 = dèinead a’ ghalair aig an ath àm ti+1, ti = àm a’ chiad tomhais (ann an làithean), ti+1 = àm an ath tomhais (ann an làithean), n = àireamh iomlan de phuingean-tìm no phuingean amhairc. Chaidh paramadairean fàis planntrais pònairean, a’ gabhail a-steach àirde a’ lus (cm), àireamh gheugan gach lus, agus àireamh dhuilleagan gach lus, a chlàradh gach seachdain airson 21 latha anns a h-uile mac-samhail bith-eòlasach.
Anns gach leth-bhreac bith-eòlasach, chaidh sampallan duille (an dàrna agus an treas duilleag làn-leasaichte bhon mhullach) a chruinneachadh air latha 45 an dèidh an làimhseachaidh (15 latha an dèidh an làimhseachaidh mu dheireadh). Bha còig poitean anns gach leth-bhreac bith-eòlasach (dà lus gach poit). Chaidh mu 500 mg den stuth brùite a chleachdadh airson pigmentan foto-cho-chur (clorophyll a, clorophyll b agus carotenoids) a thoirt a-mach a’ cleachdadh 80% acetone aig 4 °C anns an dorchadas. An dèidh 24 uair a thìde, chaidh na sampallan a chuir ann an centrifuge agus chaidh an t-supernatant a chruinneachadh airson susbaint clorophyll a, clorophyll b agus carotenoid a dhearbhadh gu dath-mheudrach a’ cleachdadh speactrophotometer UV-160A (Shimadzu Corporation, Iapan) a rèir dòigh (Lichtenthaler, 1987) le bhith a’ tomhas an absorbance aig trì tonnan-fada eadar-dhealaichte (A470, A646 agus A663 nm). Mu dheireadh, chaidh susbaint nam pigmentan foto-cho-chur obrachadh a-mach a’ cleachdadh nam foirmlean 4–6 a leanas a mhìnich Lichtenthaler (1987).
72 uair an dèidh làimhseachaidh (hpt), chaidh duilleagan (an dàrna agus an treas duilleag làn-leasaichte bhon mhullach) a chruinneachadh bho gach leth-bhreac bith-eòlasach airson suidheachadh histochemical in situ de hydrogen peroxide (H2O2) agus superoxide anion (O2•−). Bha còig poitean anns gach leth-bhreac bith-eòlasach (dà lus gach poit). Chaidh gach leth-bhreac bith-eòlasach a sgrùdadh ann an dùblachadh (dà leth-bhreac teicnigeach) gus dèanamh cinnteach à cruinneas, earbsachd agus ath-riochdachadh na modh. Chaidh H2O2 agus O2•− a dhearbhadh a’ cleachdadh 0.1% 3,3′-diaminobenzidine (DAB; Sigma-Aldrich, Darmstadt, a’ Ghearmailt) no nitroblue tetrazolium (NBT; Sigma-Aldrich, Darmstadt, a’ Ghearmailt), fa leth, a’ leantainn nan dòighean a mhìnich Romero-Puertas et al. (2004) agus Adam et al. (1989) le beagan atharrachaidhean. Airson suidheachadh histocheimiceach H2O2 in situ, chaidh na duilleagan a shìoladh a-steach do fhalamh le 0.1% DAB ann am bufair Tris 10 mM (pH 7.8) agus an uairsin gan goradh aig teòthachd an t-seòmair anns an t-solas airson 60 mionaid. Chaidh na duilleagan a ghlanadh le gealachadh ann an 0.15% (v/v) TCA ann an 4:1 (v/v) ethanol:cloroform (Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Cairo, an Èiphit) agus an uairsin gan nochdadh do sholas gus an do dhorchaich iad. San aon dòigh, chaidh na bhalbhaichean a shìoladh a-steach do fhalamh le bufair potasium phosphate 10 mM (pH 7.8) anns a bheil 0.1 w/v % HBT airson suidheachadh histocheimiceach O2•− in situ. Chaidh na duilleagan a ghoir anns an t-solas aig teòthachd an t-seòmair airson 20 mionaid, an uairsin gan gealachadh mar gu h-àrd, agus an uairsin gan lasadh gus an do nochd spotan dorcha gorma/bhiolet. Chaidh dianachd an dath donn (mar chomharradh H2O2) no gorm-bhiolet (mar chomharradh O2•−) a thig às a mheasadh a’ cleachdadh dreach Fiji den phacaid giullachd ìomhaighean ImageJ (http://fiji.sc; air a ruigsinn air 7 Màrt 2024).
Chaidh Malondialdehyde (MDA; mar chomharradh air peroxidation lipid) a dhearbhadh a rèir modh Du agus Bramlage (1992) le beagan atharrachaidhean. Chaidh duilleagan bho gach leth-bhreac bith-eòlasach (an dàrna agus an treas duilleag làn-leasaichte bhon mhullach) a chruinneachadh 72 uair an dèidh an làimhseachaidh (hpt). Bha còig poitean anns gach leth-bhreac bith-eòlasach (dà lus gach poit). Chaidh gach leth-bhreac bith-eòlasach a sgrùdadh ann an dùblachadh (dà leth-bhreac teicnigeach) gus dèanamh cinnteach à cruinneas, earbsachd agus ath-riochdachadh na modh. Gu h-aithghearr, chaidh 0.5 g de fhìoch duille talmhainn a chleachdadh airson às-tharraing MDA le 20% searbhag trichloroacetic (TCA; MilliporeSigma, Burlington, MA, USA) anns an robh 0.01% butylated hydroxytoluene (BHT; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). Chaidh susbaint MDA anns an t-supernatant a dhearbhadh gu dathimeatrach le bhith a’ tomhas an absorbance aig 532 agus 600 nm a’ cleachdadh speactrophotomeatair UV-160A (Shimadzu Corporation, Iapan) agus an uairsin chaidh a chur an cèill mar nmol g−1 FW.
Gus measadh a dhèanamh air antioxidants einnseamach agus neo-einseamach, chaidh duilleagan (an dàrna agus an treas duilleag làn-leasaichte bhon mhullach) a chruinneachadh bho gach leth-bhreac bith-eòlasach 72 uair an dèidh an làimhseachaidh (hpt). Bha còig poitean anns gach leth-bhreac bith-eòlasach (dà lus gach poit). Chaidh gach sampall bith-eòlasach a sgrùdadh ann an dùblachadh (dà shampall teicnigeach). Chaidh dà dhuilleag a mheileadh le naitridean leaghaidh agus an cleachdadh gu dìreach airson dearbhadh a dhèanamh air antioxidants einnseamach agus neo-einseamach, amino-aigéid iomlan, susbaint proline, abairt gine, agus tomhas oxalate.
Chaidh iomlan nan feinileagan so-sgaoilte a dhearbhadh le bhith a’ cleachdadh riochdaire Folin-Ciocalteu (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) le beagan atharrachaidhean air an dòigh a mhìnich Kahkonen et al. (1999). Gu h-aithghearr, chaidh timcheall air 0.1 g de fhìoch duille homogenichte a thoirt a-mach le 20 ml de 80% methanol anns an dorchadas airson 24 uair a thìde agus chaidh an t-supernatant a chruinneachadh às deidh centrifugation. Chaidh 0.1 ml den earrann sampall a mheasgachadh le 0.5 ml de riochdaire Folin-Ciocalteu (10%), a chrathadh airson 30 diogan agus fhàgail anns an dorchadas airson 5 mionaidean. An uairsin chaidh 0.5 ml de fhuasgladh sodium carbonate 20% (Na2CO3; Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies Company, Cairo, Egypt) a chur ri gach tiùb, a mheasgachadh gu mionaideach agus a ghoir aig teòthachd an t-seòmair anns an dorchadas airson 1 uair a thìde. Às deidh goir, chaidh gabhail a-steach a’ mheasgachaidh ath-bhualadh a thomhas aig 765 nm a’ cleachdadh speactrophotometer UV-160A (Shimadzu Corporation, Iapan). Chaidh dùmhlachd iomlan nam feinolan so-sgaoilte anns na h-earrannan sampall a dhearbhadh le bhith a’ cleachdadh lùb calibrachaidh searbhag gallic (Fisher Scientific, Hampton, NH, USA) agus chaidh a chur an cèill mar mhilleagram de cho-ionann searbhag gallic gach gram de chuideam ùr (mg GAE g-1 cuideam ùr).
Chaidh susbaint iomlan flavonoid so-sgaoilte a dhearbhadh a rèir modh Djeridane et al. (2006) le beagan atharrachaidhean. Gu h-aithghearr, chaidh 0.3 ml den earrann methanol gu h-àrd a mheasgachadh le 0.3 ml de fhuasgladh clòraid alùmanaim 5% (AlCl3; Fisher Scientific, Hampton, NH, USA), a mheasgachadh gu làidir agus an uairsin a ghoir aig teòthachd an t-seòmair airson 5 mionaidean, agus an uairsin chaidh 0.3 ml de fhuasgladh acetate potasium 10% (Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Cairo, Egypt) a chur ris, a mheasgachadh gu mionaideach agus a ghoir aig teòthachd an t-seòmair airson 30 mionaid anns an dorchadas. Às deidh goir, chaidh gabhail a-steach a’ mheasgachaidh ath-bhualadh a thomhas aig 430 nm a’ cleachdadh speactrophotometer UV-160A (Shimadzu Corporation, Iapan). Chaidh dùmhlachd flavonoids so-sgaoilte iomlan ann an earrannan sampall a dhearbhadh a’ cleachdadh lùb calibrachaidh rutin (TCI America, Portland, OR, USA) agus an uairsin air a chur an cèill mar mhilleagram de cho-ionann rutin gach gram de chuideam ùr (mg RE g-1 cuideam ùr).
Chaidh susbaint iomlan nan amino-aigéid shaor ann an duilleagan pònairean a thomhas le bhith a’ cleachdadh ath-bhualadair ninhydrin atharraichte (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, USA) stèidhichte air an dòigh a mhol Yokoyama agus Hiramatsu (2003) agus a chaidh atharrachadh le Sun et al. (2006). Gu h-aithghearr, chaidh 0.1 g de stuth talmhainn a thoirt a-mach le bufair pH 5.4, agus chaidh 200 μL den t-supernatant ath-bhualadh le 200 μL de ninhydrin (2%) agus 200 μL de pyridine (10%; Spectrum Chemical, New Brunswick, NJ, USA), a ghoir ann an amar uisge goileach airson 30 mionaid, an uairsin a fhuarachadh agus a thomhas aig 580 nm a’ cleachdadh speactrofotomeatair UV-160A (Shimadzu Corporation, Iapan). Air an làimh eile, chaidh proline a thomhas le dòigh Bates (Bates et al., 1973). Chaidh proline a thoirt a-mach le 3% searbhag sulfosalicylic (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, USA) agus an dèidh ceud-fhuadachadh, chaidh 0.5 ml den t-supernatant a mheasgachadh le 1 ml searbhag aiseatach eigh-shruthach (Fisher Scientific, Hampton, NH, USA) agus reagent ninhydrin, a ghoir aig 90°C airson 45 mionaid, a fhuarachadh agus a thomhas aig 520 nm a’ cleachdadh an aon speactrophotometer ris an fhear gu h-àrd. Chaidh amino-aigéid shaor iomlan agus proline anns na h-earrannan duille a thomhas a’ cleachdadh lùban calibrachaidh glycine agus proline (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA), fa leth, agus air an cur an cèill mar mg/g cuideam ùr.
Gus gnìomhachd einsímeach einsímean antioxidant a dhearbhadh, chaidh timcheall air 500 mg de fhigheagan homogenichte a thoirt a-mach le 3 ml de bhufair Tris 50 mM (pH 7.8) anns an robh 1 mM EDTA-Na2 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) agus 7.5% polyvinylpyrrolidone (PVP; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), a chuir ann an inneal-snìomh aig 10,000 × g airson 20 mionaid fo fhuarachadh (4 °C), agus chaidh an t-supernatant (earrann einsím amh) a chruinneachadh (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023). Chaidh Catalase (CAT) an uair sin ath-bhualadh le 2 ml de bufair fosfáit sodium 0.1 M (pH 6.5; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) agus 100 μl de fhuasgladh 269 mM H2O2 gus a ghnìomhachd einnseamach a dhearbhadh a rèir dòigh Aebi (1984) le beagan atharrachaidhean (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023). Chaidh gnìomhachd einnseamach peroxidase an urra ri Guaiacol (POX) a dhearbhadh a’ cleachdadh dòigh Harrach et al. (2009). (2008) le beagan atharrachaidhean (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023) agus chaidh gnìomhachd einnseamach polyphenol oxidase (PPO) a dhearbhadh an dèidh ath-bhualadh le 2.2 ml de 100 mM sodium phosphate buffer (pH 6.0), 100 μl de guaiacol (TCI chemicals, Portland, OR, USA) agus 100 μl de 12 mM H2O2. Chaidh an dòigh-obrach atharrachadh beagan bho (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023). Chaidh an deuchainn a dhèanamh an dèidh ath-bhualadh le 3 ml de fhuasgladh catechol (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, USA) (0.01 M) ùr-ullaichte ann am 0.1 M phosphate buffer (pH 6.0). Chaidh gnìomhachd CAT a thomhas le bhith a’ cumail sùil air lobhadh H2O2 aig 240 nm (A240), chaidh gnìomhachd POX a thomhas le bhith a’ cumail sùil air an àrdachadh ann an gabhail a-steach aig 436 nm (A436), agus chaidh gnìomhachd PPO a thomhas le bhith a’ clàradh atharrachaidhean ann an gabhail a-steach aig 495 nm (A495) a h-uile 30 diog airson 3 mionaidean a’ cleachdadh speactrofotomeatair UV-160A (Shimadzu, Iapan).
Chaidh RT-PCR fìor-ùine a chleachdadh gus ìrean tar-sgrìobhaidh trì ginean co-cheangailte ri antioxidants a lorg, a’ gabhail a-steach catalase peroxisomal (PvCAT1; Àireamh Inntrigidh GenBank KF033307.1), superoxide dismutase (PvSOD; Àireamh Inntrigidh GenBank XM_068639556.1), agus glutathione reductase (PvGR; Àireamh Inntrigidh GenBank KY195009.1), ann an duilleagan pònairean (an dàrna agus an treas duilleag làn-leasaichte bhon mhullach) 72 uair an dèidh an làimhseachaidh mu dheireadh. Gu h-aithghearr, chaidh RNA a sgaradh a’ cleachdadh Simply P Total RNA Extraction Kit (Àireamh Cat. BSC52S1; BioFlux, Biori Technology, Sìona) a rèir protocol an neach-dèanamh. An uairsin, chaidh cDNA a cho-chur a’ cleachdadh Pasgan Co-chur cDNA TOP script™ a rèir stiùiridhean an neach-dèanamh. Tha sreathan primer nan trì ginean gu h-àrd air an liostadh ann an Clàr a bharrachd S3. Chaidh PvActin-3 (àireamh inntrigidh GenBank: XM_068616709.1) a chleachdadh mar an gine gleidhidh-taighe agus chaidh an abairt gine coimeasach obrachadh a-mach a’ cleachdadh an dòigh 2-ΔΔCT (Livak agus Schmittgen, 2001). Chaidh seasmhachd actin fo chuideam bith-eòlasach (eadar-obrachadh neo-fhreagarrach eadar pònairean cumanta agus am fungas anthracnose Colletotrichum lindemuthianum) agus cuideam neo-bhitheach (tart, saillteachd, teòthachd ìosal) a nochdadh (Borges et al., 2012).
An toiseach, rinn sinn mion-sgrùdadh in silico air feadh a’ ghineim air pròtainean oxaloacetate acetylhydrolase (OAH) ann an S. sclerotiorum a’ cleachdadh an inneal BLAST pròtain-phròtain (BLASTp 2.15.0+) (Altschul et al., 1997, 2005). Gu h-aithghearr, chleachd sinn OAH bho Aspergillus fijiensis CBS 313.89 (AfOAH; taxide: 1191702; àireamh inntrigidh GenBank XP_040799428.1; 342 amino-aigéid) agus Penicillium lagena (PlOAH; taxide: 94218; àireamh inntrigidh GenBank XP_056833920.1; 316 amino-aigéid) mar shreathan ceiste gus am pròtain co-chosmhail ann an S. sclerotiorum (taxide: 5180) a mhapadh. Chaidh BLASTp a dhèanamh an aghaidh an dàta genome S. sclerotiorum as ùire a bha ri fhaighinn ann an GenBank air làrach-lìn an Ionad Nàiseanta airson Fiosrachadh Bith-theicneòlais (NCBI), http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/.
A bharrachd air sin, chaidh an gine OAH a chaidh a ro-innse bho S. sclerotiorum (SsOAH) agus an anailis mean-fhàsach agus craobh fìleogenetach AfOAH bho A. fijiensis CBS 313.89 agus PlOAH bho P. lagena a thoirt a-mach a’ cleachdadh an dòigh-obrach as motha de chothrom ann am MEGA11 (Tamura et al., 2021) agus am modail stèidhichte air maitrís JTT (Jones et al., 1992). Chaidh a’ chraobh fìleogenetach a chur còmhla ris an anailis ioma-thaobhadh de shreathan pròtain de na ginean OAH a chaidh a ro-innse uile (SsOAH) bho S. sclerotiorum agus an t-sreath ceiste a’ cleachdadh an Constraint-Based Alignment Tool (COBALT; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/cobalt/re_cobalt.cgi) (Papadopoulos agus Agarwala, 2007). A bharrachd air sin, chaidh na sreathan amino-aigéid as fheàrr de SsOAH bho S. sclerotiorum a cho-thaobhadh ris na sreathan ceiste (AfOAH agus PlOAH) (Larkin et al., 2007) a’ cleachdadh ClustalW (http://www.genome.jp/tools-bin/clustalw), agus chaidh roinnean glèidhte san cho-thaobhadh a dhèanamh follaiseach a’ cleachdadh an inneal ESPript (dreach 3.0; https://espript.ibcp.fr/ESPript/ESPript/index.php).
A bharrachd air sin, chaidh na raointean riochdachail gnìomhach ro-innseach agus na làraichean glèidhte de S. sclerotiorum SsOAH a sheòrsachadh gu h-eadar-ghnìomhach ann an diofar theaghlaichean a’ cleachdadh an inneal InterPro (https://www.ebi.ac.uk/interpro/) (Blum et al., 2021). Mu dheireadh, chaidh modaladh structar trì-thaobhach (3D) den S. sclerotiorum SsOAH ro-innseach a dhèanamh a’ cleachdadh an Protein Homology/Analogy Recognition Engine (frithealaiche Phyre2 dreach 2.0; http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/~phyre2/html/page.cgi?id=index) (Kelley et al., 2015) agus chaidh a dhearbhadh a’ cleachdadh an fhrithealaiche SWISS-MODEL (https://swissmodel.expasy.org/) (Biasini et al., 2014). Chaidh na structaran trì-thaobhach a bha ro-innseach (cruth PDB) a dhèanamh follaiseach gu h-eadar-ghnìomhach a’ cleachdadh pasgan UCSF-Chimera (dreach 1.15; https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/) (Pettersen et al., 2004).
Chaidh PCR fluorescence fìor-ùine cainníomach a chleachdadh gus ìre tar-sgrìobhaidh oxaloacetate acetylhydrolase (SsOAH; àireamh inntrigidh GenBank: XM_001590428.1) a dhearbhadh ann am mycelia Sclerotinia sclerotiorum. Gu h-aithghearr, chaidh S. sclerotiorum a chur ann am flasg anns an robh PDB agus a chur ann an goireadair-crathaidh (modail: I2400, New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ, USA) aig 25 ± 2 °C airson 24 uair aig 150 rpm agus ann an dorchadas cunbhalach (24 uair) gus fàs mycelial a bhrosnachadh. Às deidh sin, chaidh na ceallan a làimhseachadh le L-ornithine agus an druga-fuadain Rizolex-T aig dùmhlachdan IC50 deireannach (timcheall air 40 agus 3.2 mg / L, fa leth) agus an uairsin chaidh an cultar airson 24 uair eile fo na h-aon chumhachan. Às dèidh an goinneadaireachd, chaidh na cultaran a shnìomh-chriathrag aig 2500 rpm airson 5 mionaidean agus chaidh an t-supernatant (mycelium fungach) a chruinneachadh airson mion-sgrùdadh air abairt gine. San aon dòigh, chaidh mycelium fungach a chruinneachadh aig 0, 24, 48, 72, 96, agus 120 uair an dèidh galar bho lusan gabhaltach a bha air molltair geal agus mycelium cotanach a chruthachadh air uachdar fhigheagan gabhaltach. Chaidh RNA a thoirt a-mach às a’ mycelium fungach agus an uairsin chaidh cDNA a cho-chur mar a chaidh a mhìneachadh gu h-àrd. Tha na sreathan primer airson SsOAH air an liostadh ann an Clàr a bharrachd S3. Chaidh SsActin (àireamh inntrigidh GenBank: XM_001589919.1) a chleachdadh mar an gine gleidhidh-taighe, agus chaidh abairt gine coimeasach obrachadh a-mach a’ cleachdadh an dòigh 2-ΔΔCT (Livak agus Schmittgen, 2001).
Chaidh searbhag oxalic a dhearbhadh ann am broth dextrose buntàta (PDB) agus sampallan planntrais anns an robh am pathogen fungach Sclerotinia sclerotiorum a rèir dòigh Xu agus Zhang (2000) le beagan atharrachaidhean. Gu h-aithghearr, chaidh isolates S. sclerotiorum a chur ann am flasgan anns an robh PDB agus an uairsin gan cultar ann an goireadair-crathaidh (modail I2400, New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ, USA) aig 150 rpm aig 25 ± 2 °C airson 3–5 latha ann an dorchadas cunbhalach (24 uair) gus fàs mycelium a bhrosnachadh. Às deidh goireadair, chaidh a’ chultar fungach a shìoladh an toiseach tro phàipear-sìoltachain Whatman #1 agus an uairsin a chuir ann an centrifuge aig 2500 rpm airson 5 mionaidean gus am mycelium a bha air fhàgail a thoirt air falbh. Chaidh an supernatant a chruinneachadh agus a stòradh aig 4 ° C airson tuilleadh dearbhaidh cainneachdail air oxalate. Airson ullachadh sampallan planntrais, chaidh timcheall air 0.1 g de phìosan clò planntrais a thoirt a-mach trì tursan le uisge grùide (2 ml gach uair). Chaidh na sampallan an uair sin a chuir ann an inneal-snìomh aig 2500 rpm airson 5 mionaidean, chaidh an t-snàithleach a shìoladh gu tioram tro phàipear-sìoltachain Whatman Àir. 1 agus a chruinneachadh airson tuilleadh anailis.
Airson mion-sgrùdadh cainneachdail air searbhag oxalic, chaidh am measgachadh ath-bhualadh ullachadh ann an tiùb le stad glainne san òrdugh a leanas: 0.2 ml de shampall (no sìoltachan cultar PDB no fuasgladh àbhaisteach searbhag oxalic), 0.11 ml de ghorm bromophenol (BPB, 1 mM; Fisher Chemical, Pittsburgh, PA, USA), 0.198 ml de dh’aigéad sulfarach 1 M (H2SO4; Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Cairo, an Èiphit) agus 0.176 ml de dhì-chromat potasium 100 mM (K2Cr2O7; TCI chemicals, Portland, OR, USA), agus an uairsin chaidh am fuasgladh a lagachadh gu 4.8 ml le uisge grùide, a mheasgachadh gu làidir agus a chur sa bhad ann an amar-uisge 60 °C. Às dèidh 10 mionaidean, chaidh an ath-bhualadh a stad le bhith a’ cur 0.5 ml de fhuasgladh sodium hydroxide (NaOH; 0.75 M) ris. Chaidh gabhail a-steach (A600) a’ mheasgachaidh ath-bhualaidh a thomhas aig 600 nm a’ cleachdadh speactrofotomeatair UV-160 (Shimadzu Corporation, Iapan). Chaidh PDB agus uisge grùide a chleachdadh mar smachdan airson tomhas sìoltachain cultar agus sampallan planntrais, fa leth. Chaidh dùmhlachd searbhag oxalic anns na sìoltachain cultar, air an cur an cèill mar mhicreagraman de dh’aigéad oxalic gach mililiter de mheadhan PDB (μg.mL−1), agus anns na h-earrannan duille, air an cur an cèill mar mhicreagraman de dh’aigéad oxalic gach gram de chuideam ùr (μg.g−1 FW), a dhearbhadh a’ cleachdadh lùb calabrachaidh searbhag oxalic (Thermo Fisher Scientific Chemicals, Waltham, MA, USA).
Tron sgrùdadh, chaidh na deuchainnean uile a dhealbhadh ann an dealbhadh gu tur air thuaiream (CRD) le sia ath-aithrisean bith-eòlasach gach làimhseachadh agus còig poitean gach ath-aithris bith-eòlasach (dà lus gach poit) mura h-eilear ag ràdh a chaochladh. Chaidh ath-aithrisean bith-eòlasach a sgrùdadh ann an dùblachadh (dà ath-aithris theicnigeach). Chaidh ath-aithrisean teicnigeach a chleachdadh gus ath-riochdachadh an aon deuchainn a dhearbhadh ach cha deach an cleachdadh anns an anailis staitistigeil gus ath-aithrisean meallta a sheachnadh. Chaidh dàta a sgrùdadh gu staitistigeil a’ cleachdadh mion-sgrùdadh atharrachaidh (ANOVA) agus an uairsin deuchainn eadar-dhealachaidh cudromach onarach Tukey-Kramer (HSD) (p ≤ 0.05). Airson deuchainnean in vitro, chaidh luachan IC50 agus IC99 obrachadh a-mach a’ cleachdadh modail probit agus chaidh eadar-amaichean earbsa 95% obrachadh a-mach.
Chaidh ceithir eisimpleirean gu h-iomlan a chruinneachadh bho dhiofar raointean pònairean soighe ann an Riaghladair El Ghabiya, an Èiphit. Air meadhan PDA, rinn na h-eisimpleirean uile mycelium geal uachdarach a thionndaidh gu geal cotanach gu sgiobalta (Figear 1A) agus an uairsin beige no donn aig ìre an sclerotium. Mar as trice bidh sclerotia dùmhail, dubh, cruinn no neo-riaghailteach ann an cumadh, 5.2 gu 7.7 mm a dh'fhaid agus 3.4 gu 5.3 mm ann an trast-thomhas (Figear 1B). Ged a leasaich ceithir eisimpleirean pàtran imeallach de sclerotia aig oir a’ mheadhain chultaraich às deidh 10–12 latha de ghoir aig 25 ± 2 °C (Figear 1A), bha an àireamh de sclerotia gach truinnsear gu math eadar-dhealaichte eatorra (P < 0.001), le eisimpleir 3 leis an àireamh as àirde de sclerotia (32.33 ± 1.53 sclerotia gach truinnsear; Figear 1C). San aon dòigh, rinn isolate #3 barrachd searbhag oxalic ann am PDB na isolates eile (3.33 ± 0.49 μg.mL−1; Figear 1D). Sheall Isolate #3 feartan morf-eòlach is microscopach àbhaisteach den fhungas phytopathogenic Sclerotinia sclerotiorum. Mar eisimpleir, air PDA, dh’fhàs coloinidhean de isolate #3 gu luath, bha iad geal uachdar (Figear 1A), beige cùil no buidhe-donn bradain aotrom, agus bha feum aca air 6-7 latha aig 25 ± 2°C gus uachdar truinnsear 9 cm ann an trast-thomhas a chòmhdach gu tur. Stèidhichte air na feartan morf-eòlach is microscopach gu h-àrd, chaidh isolate #3 a chomharrachadh mar Sclerotinia sclerotiorum.
Figear 1. Feartan agus pathogenicity eisimplearan S. sclerotiorum bho bhàrr legume cumanta. (A) Fàs mycelial ceithir eisimplearan S. sclerotiorum air meadhan PDA, (B) sclerotia ceithir eisimplearan S. sclerotiorum, (C) àireamh sclerotia (gach plàta), (D) secretion searbhag oxalic air meadhan PDB (μg.mL−1), agus (E) dèinead galair (%) ceithir eisimplearan S. sclerotiorum air cultivar legume malairteach so-leònte Giza 3 fo chumhachan taigh-glainne. Tha luachan a’ riochdachadh a’ chuibheasachd ± SD de chòig ath-aithrisean bith-eòlasach (n = 5). Tha litrichean eadar-dhealaichte a’ comharrachadh eadar-dhealachaidhean staitistigeil cudromach eadar leigheasan (p < 0.05). (F–H) Nochd comharran molltair geal àbhaisteach air gasan os cionn na talmhainn agus siliques, fa leth, 10 latha às deidh banachdach le eisimplear #3 (dpi). (I) Chaidh mion-sgrùdadh mean-fhàsach air roinn an spacer tar-sgrìobhte a-staigh (ITS) de S. sclerotiorum isolate #3 a dhèanamh a’ cleachdadh an dòigh as motha de chothrom agus chaidh coimeas a dhèanamh eadar e agus 20 isolate/sreath fiosrachaidh a fhuaireadh bhon stòr-dàta Ionad Nàiseanta airson Fiosrachadh Bith-theicneòlais (NCBI) (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Tha na h-àireamhan os cionn nan loidhnichean cruinneachaidh a’ comharrachadh còmhdach na sgìre (%), agus tha na h-àireamhan fo na loidhnichean cruinneachaidh a’ comharrachadh fad a’ mheur.
A bharrachd air sin, gus dearbhadh a dhèanamh air a’ phataigineachd, chaidh ceithir eisimplearan S. sclerotiorum a fhuaireadh a chleachdadh gus an cultivar pònaire malairteach so-leònte Giza 3 a bhannachadh fo chumhachan taigh-glainne, a tha a rèir barailean Koch (Figear 1E). Ged a bha na h-eisimplearan fungach uile a fhuaireadh paitaigineach agus gum b’ urrainn dhaibh am pònaire uaine (cv. Giza 3) a ghlacadh, ag adhbhrachadh comharran molltair geal àbhaisteach air a h-uile pàirt os cionn na talmhainn (Figear 1F), gu sònraichte air na gasan (Figear 1G) agus na croinn (Figear 1H) 10 latha às dèidh a’ bhannachaidh (dpi), b’ e eisimplear 3 an eisimplear as ionnsaigheach ann an dà dheuchainn neo-eisimeileach. Bha an ìre galair as àirde (%) aig Eisimplear 3 air lusan pònaire (24.0 ± 4.0, 58.0 ± 2.0, agus 76.7 ± 3.1 aig 7, 14, agus 21 latha às dèidh a’ ghalair, fa leth; Figear 1F).
Chaidh dearbhadh a dhèanamh air an S. sclerotiorum isolate #3 as ionnsaigheach stèidhichte air sreath-sgrùdadh spacer tar-sgrìobhte a-staigh (ITS) (Figear 1I). Sheall mion-sgrùdadh fìlogeneatach eadar isolate #3 agus 20 isolate/sreath iomraidh coltas àrd (>99%) eatorra. Is fhiach a thoirt fa-near gu bheil coltas àrd aig an S. sclerotiorum isolate #3 (533 bp) ris an S. sclerotiorum isolate Ameireaganach LPM36 a chaidh a sgaradh bho shìol pea tioram (àireamh inntrigidh GenBank MK896659.1; 540 bp) agus an S. sclerotiorum isolate Sìneach YKY211 (àireamh inntrigidh GenBank OR206374.1; 548 bp), a dh’ adhbhraicheas lobhadh gas violet (Matthiola incana), agus tha iad uile air an cruinneachadh air leth aig mullach an dendrogram (Figear 1I). Chaidh an sreath ùr a thasgadh ann an stòr-dàta NCBI agus chaidh ainmeachadh mar “Sclerotinia sclerotiorum – isolate YN-25” (àireamh inntrigidh GenBank PV202792). Chithear gur e isolate 3 an isolate as ionnsaigheach; mar sin, chaidh an isolate seo a thaghadh airson sgrùdadh anns a h-uile deuchainn às dèidh sin.
Chaidh gnìomhachd antibacterial an diamine L-ornithine (Sigma-Aldrich, Darmstadt, a' Ghearmailt) aig diofar dùmhlachdan (12.5, 25, 50, 75, 100 agus 125 mg/L) an aghaidh S. sclerotiorum isolate 3 a sgrùdadh in vitro. Is fhiach a thoirt fa-near gun robh buaidh antibacterial aig L-ornithine agus gun do chuir e bacadh mean air mhean air fàs radaigeach S. sclerotiorum hyphae ann an dòigh a bha an urra ris an dòs (Figear 2A, B). Aig an dùmhlachd as àirde a chaidh a dhearbhadh (125 mg/L), sheall L-ornithine an ìre bacaidh fàs mycelial as àirde (99.62 ± 0.27%; Figear 2B), a bha co-ionann ris an fhungas-leigheis malairteach Rizolex-T (ìre bacaidh 99.45 ± 0.39%; Figear 2C) aig an dùmhlachd as àirde a chaidh a dhearbhadh (10 mg/L), a’ nochdadh èifeachdas coltach ris.
Figear 2. Gnìomhachd antibacterial in vitro de L-ornithine an aghaidh Sclerotinia sclerotiorum. (A) Coimeas eadar gnìomhachd antibacterial diofar cho-chruinneachaidhean de L-ornithine an aghaidh S. sclerotiorum leis an fhungas-leighis malairteach Rizolex-T (10 mg/L). (B, C) Ìre casg (%) de fhàs mycelial S. sclerotiorum às dèidh làimhseachadh le diofar cho-chruinneachaidhean de L-ornithine (12.5, 25, 50, 75, 100 agus 125 mg/L) no Rizolex-T (2, 4, 6, 8 agus 10 mg/L), fa leth. Tha luachan a’ riochdachadh a’ chuibheasachd ± SD de chòig ath-aithrisean bith-eòlasach (n = 5). Tha litrichean eadar-dhealaichte a’ comharrachadh eadar-dhealachaidhean staitistigeil eadar làimhseachadh (p < 0.05). (D, E) Mion-sgrùdadh ath-tharraing modail Probit de L-ornithine agus fungas-leighis malairteach Rizolex-T, fa leth. Tha loidhne ath-tharraing modail probit air a shealltainn mar loidhne ghorm sholadach, agus tha an raon earbsa (95%) air a shealltainn mar loidhne dhearg bhriste.
A bharrachd air sin, chaidh mion-sgrùdadh ath-tharraing probit a dhèanamh agus tha na plotaichean co-fhreagarrach air an sealltainn ann an Clàr 1 agus Figearan 2D,E. Gu h-aithghearr, chomharraich an luach leathad iomchaidh (y = 2.92x − 4.67) agus staitistig chudromach co-cheangailte (Cox & Snell R2 = 0.3709, Nagelkerke R2 = 0.4998 agus p < 0.0001; Figear 2D) de L-ornithine gnìomhachd antifungal nas fheàrr an aghaidh S. sclerotiorum an taca ris an druga-fhungais malairteach Rizolex-T (y = 1.96x − 0.99, Cox & Snell R2 = 0.1242, Nagelkerke R2 = 0.1708 agus p < 0.0001) (Clàr 1).
Clàr 1. Luachan leth-uasmhéid dùmhlachd bacaidh (IC50) agus IC99 (mg/l) de L-ornithine agus am fungas-leighis malairteach “Rizolex-T” an aghaidh S. sclerotiorum.
Gu h-iomlan, lughdaich L-ornithine (250 mg/L) leasachadh agus dèinead molltair gheal gu mòr air lusan pònairean cumanta air an làimhseachadh an taca ri lusan air an robh S. sclerotiorum air an làimhseachadh (smachd; Figear 3A). Gu h-aithghearr, ged a dh’ èirich dèinead a’ ghalair ann an lusan smachd air an robh galair gun làimhseachadh mean air mhean (52.67 ± 1.53, 83.21 ± 2.61, agus 92.33 ± 3.06%), lughdaich L-ornithine dèinead a’ ghalair (%) gu mòr tron ​​deuchainn (8.97 ± 0.15, 18.00 ± 1.00, agus 26.36 ± 3.07) aig 7, 14, agus 21 latha às dèidh an làimhseachaidh (dpt), fa leth (Figear 3A). San aon dòigh, nuair a chaidh planntaichean pònairean air an robh S. sclerotiorum air an làimhseachadh le 250 mg/L L-ornithine, lùghdaich an raon fo lùb adhartais a’ ghalair (AUDPC) bho 1274.33 ± 33.13 anns a’ bhuidheann smachd gun làimhseachadh gu 281.03 ± 7.95, a bha beagan nas ìsle na an raon den fungicide Rizolex-T 50 mg/L smachd adhartach (183.61 ± 7.71; Figear 3B). Chaidh an aon ghluasad fhaicinn san dàrna deuchainn.
Figear 3. Buaidh cleachdadh eas-ghinealach L-ornithine air leasachadh lobhadh geal pònairean cumanta air adhbhrachadh le Sclerotinia sclerotiorum fo chumhachan taigh-glainne. (A) Lùb adhartais galair molltair geal pònairean cumanta às dèidh làimhseachadh le 250 mg/L L-ornithine. (B) An raon fo lùb adhartais galair (AUDPC) de mholltair geal pònairean cumanta às dèidh làimhseachadh le L-ornithine. Tha na luachan a’ riochdachadh a’ chuibheasachd ± SD de chòig ath-aithrisean bith-eòlasach (n = 5). Tha litrichean eadar-dhealaichte a’ comharrachadh eadar-dhealachaidhean a tha cudromach gu staitistigeil eadar làimhseachadh (p < 0.05).
Mheudaich cleachdadh exogenous de 250 mg/L L-ornithine àirde a’ phlannt mean air mhean (Figear 4A), àireamh nan geugan gach lus (Figear 4B), agus àireamh nan duilleagan gach lus (Figear 4C) an dèidh 42 latha. Ged a b’ e am fungas-fhungas malairteach Rizolex-T (50 mg/L) a thug a’ bhuaidh as motha air na paramadairean beathachaidh uile a chaidh a sgrùdadh, b’ e cleachdadh exogenous de 250 mg/L L-ornithine a thug an dàrna buaidh as motha an taca ri smachdan gun làimhseachadh (Figearan 4A–C). Air an làimh eile, cha robh buaidh mhòr sam bith aig làimhseachadh L-ornithine air susbaint nam pigmentan foto-cho-chur clorophyll a (Figear 4D) agus clorophyll b (Figear 4E), ach mheudaich e beagan an susbaint carotenoid iomlan (0.56 ± 0.03 mg/g fr wt) an taca ris a’ smachd àicheil (0.44 ± 0.02 mg/g fr wt) agus an smachd deimhinneach (0.46 ± 0.02 mg/g fr wt; Figear 4F). Gu h-iomlan, tha na toraidhean seo a’ nochdadh nach eil L-ornithine phytotoxic do phònairean air an làimhseachadh agus gum faodadh e eadhon am fàs a bhrosnachadh.
Figear 4. Buaidh cleachdadh L-ornithine exogenous air feartan fàis agus pigmentan foto-cho-chur dhuilleagan pònairean air an robh Sclerotinia sclerotiorum fo chumhachan taigh-glainne. (A) Àirde a’ phlannt (cm), (B) Àireamh gheugan gach lus, (C) Àireamh dhuilleagan gach lus, (D) Susbaint clorophyll a (mg g-1 fr wt), (E) Susbaint clorophyll b (mg g-1 fr wt), (F) Susbaint carotenoid iomlan (mg g-1 fr wt). Is e na luachan an cuibheasachd ± SD de chòig ath-aithrisean bith-eòlasach (n = 5). Tha litrichean eadar-dhealaichte a’ comharrachadh eadar-dhealachaidhean staitistigeil cudromach eadar làimhseachadh (p < 0.05).
Nochd suidhseachadh histochemical in situ de ghnèithean ocsaidean ath-ghnìomhach (ROS; air an cur an cèill mar haidridean piorocsaid [H2O2]) agus radicals saor (air an cur an cèill mar anionan superoxide [O2•−]) gun do lughdaich cleachdadh exogenous de L-ornithine (250 mg/L) cruinneachadh H2O2 (96.05 ± 5.33 nmol.g−1 FW; Figear 5A) agus O2•− (32.69 ± 8.56 nmol.g−1 FW; Figear 5B) gu mòr an taca ri cruinneachadh an dà chuid lusan gabhaltach gun làimhseachadh (173.31 ± 12.06 agus 149.35 ± 7.94 nmol.g−1 FW, fa leth) agus lusan air an làimhseachadh le 50 mg/L den fhungas-fhungas malairteach Rizolex-T (170.12 ± 9.50 agus 157.00 ± 7.81 nmol.g−1 fr wt, fa leth) aig 72 uair. Chruinnich ìrean àrda de H2O2 agus O2•− fo hpt (Figear 5A, B). San aon dòigh, sheall deuchainn malondialdehyde (MDA) stèidhichte air TCA gun do chruinnich planntaichean pònairean air an robh S. sclerotiorum air an galarachadh ìrean nas àirde de MDA (113.48 ± 10.02 nmol.g fr wt) nan duilleagan (Figear 5C). Ach, lughdaich cleachdadh exogenous de L-ornithine peroxidation lipid gu mòr mar a chithear bhon lùghdachadh ann an susbaint MDA ann an lusan air an làimhseachadh (33.08 ± 4.00 nmol.g fr wt).
Figear 5. Buaidh cleachdadh L-ornithine exogenous air prìomh chomharran cuideam oxidative agus uidheaman dìon antioxidant neo-ensaimeach ann an duilleagan pònairean air an galarachadh le S. sclerotiorum aig 72 uair an dèidh galar fo chumhachan taigh-glainne. (A) Haidridean piorocsaid (H2O2; nmol g−1 FW) aig 72 hpt, (B) anion superoxide (O2•−; nmol g−1 FW) aig 72 hpt, (C) malondialdehyde (MDA; nmol g−1 FW) aig 72 hpt, (D) phenols soluble iomlan (mg GAE g−1 FW) aig 72 hpt, (E) flavonoids soluble iomlan (mg RE g−1 FW) aig 72 hpt, (F) amino-aigéid shaor iomlan (mg g−1 FW) aig 72 hpt, agus (G) susbaint proline (mg g−1 FW) aig 72 hpt. Tha na luachan a’ riochdachadh a’ chuibheasachd ± an claonadh àbhaisteach (cuibheasachd ± SD) de 5 ath-aithrisean bith-eòlasach (n = 5). Tha litrichean eadar-dhealaichte a’ comharrachadh eadar-dhealachaidhean a tha cudromach gu staitistigeil eadar leigheasan (p < 0.05).