Tapadh leibh airson tadhal air Nature.com. Tha taic CSS cuibhrichte aig an dreach den bhrobhsair a tha thu a’ cleachdadh. Airson na toraidhean as fheàrr, tha sinn a’ moladh gun cleachd thu dreach nas ùire den bhrobhsair agad (no gun cuir thu dheth Modh Co-chòrdalachd ann an Internet Explorer). Aig an aon àm, gus dèanamh cinnteach à taic leantainneach, tha sinn a’ sealltainn an làraich gun stoidhle no JavaScript.
Bithear a’ cleachdadh searbhag propionic (PPA) gus sgrùdadh a dhèanamh air àite mì-ghnìomhachd mitochondrial ann an eas-òrdughan neuro-leasachaidh leithid eas-òrdugh speactram autism. Tha fios gu bheil PPA a’ cur dragh air biogenesis, metabolism agus tionndadh mitochondrial. Ach, tha buaidhean PPA air daineamaigs mitochondrial, fiseadh agus co-aonadh fhathast duilich air sgàth nàdar sealach iom-fhillte nan uidheaman sin. An seo, bidh sinn a’ cleachdadh dhòighean ìomhaighean cainneachdail co-phàirteach gus sgrùdadh a dhèanamh air mar a bheir PPA buaidh air ultrastructure, morf-eòlas agus daineamaigs mitochondrial ann an ceallan SH-SY5Y coltach ri neuron. Dh’ adhbhraich PPA (5 mM) lùghdachadh mòr ann an raon mitochondrial (p < 0.01), trast-thomhas agus cuairt-thomhas feret (p < 0.05), agus raon 2 (p < 0.01). Sheall mion-sgrùdadh lorgadair tachartais mitochondrial àrdachadh mòr (p < 0.05) ann an tachartasan fiseadh agus co-aonadh, agus mar sin a’ cumail suas ionracas lìonra mitochondrial fo chumhachan cuideam. A bharrachd air an sin, chaidh lùghdachadh mòr a thoirt air abairteachadh mRNA cMYC (p < 0.0001), NRF1 (p < 0.01), TFAM (p < 0.05), STOML2 (p < 0.0001) agus OPA1 (p < 0.05). 01). Tha seo a’ sealltainn ath-dhealbhadh morf-eòlas, bith-ghinealachd agus daineamaigs mitochondrial gus gnìomh a chumail suas fo chumhachan cuideam. Tha an dàta againn a’ toirt sealladh ùr air buaidhean PPA air daineamaigs mitochondrial agus a’ soilleireachadh cho feumail sa tha dòighean ìomhaighean airson sgrùdadh a dhèanamh air na dòighean riaghlaidh iom-fhillte a tha an sàs ann am freagairtean cuideam mitochondrial.
Tha mitochondria nam pàirt riatanach ann an grunn ghnìomhan ceallach a bharrachd air na dreuchdan àbhaisteach aca ann an cinneasachadh lùtha agus bith-cho-chur. Tha metabolism mitochondrial na phrìomh riaghlaiche air comharran calcium, homeostasis metabolach agus redox, comharran sèididh, atharrachaidhean epigenetic, iomadachadh cheallan, eadar-dhealachadh agus bàs cealla prògramaichte1. Gu sònraichte, tha metabolism mitochondrial deatamach airson leasachadh, mairsinn agus gnìomh neuronal agus tha e gu farsaing an sàs ann an diofar thaisbeanaidhean de neuropathology2,3,4.
Thar an deich bliadhna a dh’fhalbh, tha inbhe metabolach air nochdadh mar phrìomh riaghlaiche air neurogenesis, eadar-dhealachadh, aibidh agus plasticity5,6. O chionn ghoirid, tha morf-eòlas agus daineamaigs mitochondrial air a bhith nan co-phàirtean gu sònraichte cudromach de mitosis, pròiseas daineamaigeach a chumas suas amar de mitochondria fallain taobh a-staigh cheallan. Tha daineamaigs mitochondrial air an riaghladh le slighean eadar-eisimeileach iom-fhillte a’ dol bho bhithogenesis agus bioenergetics mitochondrial gu sgoltadh, co-aonadh, còmhdhail agus glanadh mitochondrial7,8. Bidh briseadh gin de na dòighean amalachaidh sin a’ cur bacadh air cumail suas lìonraidhean mitochondrial fallain agus tha builean gnìomhach domhainn aige airson neurodevelopment9,10. Gu dearbh, thathas a’ faicinn mì-riaghladh daineamaigs mitochondrial ann an iomadh eas-òrdugh inntinn-inntinn, neurodegenerative agus neurodevelopmental, a’ gabhail a-steach eas-òrdughan speactram autism (ASD)11,12.
'S e eas-òrdugh neuro-leasachaidh heterogeneous a th' ann an ASD le ailtireachd ginteil is epigenetic iom-fhillte. Chan eil deasbad ann mu oighreachas ASD, ach tha an etiology moileciuil bunaiteach fhathast air a thuigsinn gu dona. Tha cruinneachadh dàta bho mhodalan ro-clionaigeach, sgrùdaidhean clionaigeach, agus seataichean dàta moileciuil ioma-omics a’ toirt seachad fianais a tha a’ sìor fhàs air mì-ghnìomhachd mitochondrial ann an ASD13,14. Rinn sinn roimhe seo sgrìonadh methylation DNA air feadh an genome ann an cohort de dh’ euslaintich le ASD agus chomharraich sinn ginean le diofar methylation cruinnichte air slighean metabolach mitochondrial15. Às deidh sin, thug sinn cunntas air methylation eadar-dhealaichte de riaghladairean meadhanach biogenesis agus daineamaigs mitochondrial, a bha co-cheangailte ri àireamh leth-bhreac mtDNA nas motha agus pròifil metabolach urinary atharraichte ann an ASD16. Tha an dàta againn a’ toirt seachad fianais a tha a’ sìor fhàs gu bheil daineamaigs mitochondrial agus homeostasis a’ cluich pàirt chudromach ann am pathophysiology ASD. Mar sin, tha leasachadh air an tuigse meacanaigeach air a’ cheangal eadar daineamaigs mitochondrial, morf-eòlas, agus gnìomh na phrìomh amas airson rannsachadh leantainneach air galairean neurolach air an comharrachadh le mì-ghnìomhachd mitochondrial àrd-sgoile.
Bithear tric a’ cleachdadh dhòighean moileciuil gus sgrùdadh a dhèanamh air àite ghinean sònraichte ann am freagairtean cuideam mitochondrial. Ach, dh’ fhaodadh an dòigh-obrach seo a bhith cuibhrichte leis an nàdar ioma-fhillte agus sealach de dhòighean-obrach smachd mitotic. A bharrachd air an sin, tha eadar-dhealachadh ann an abairt ghinean mitochondrial na chomharradh neo-dhìreach air atharrachaidhean gnìomh, gu sònraichte leis nach eil ach àireamh chuingealaichte de ghinean air an sgrùdadh mar as trice. Mar sin, chaidh dòighean nas dìriche a mholadh airson gnìomh mitochondrial agus bioenergetics a sgrùdadh17. Tha morf-eòlas mitochondrial gu dlùth cheangailte ri daineamaigs mitochondrial. Tha cumadh, ceangal agus structar mitochondrial deatamach airson cinneasachadh lùtha agus mairsinn mitochondrial agus cealla5,18. A bharrachd air an sin, tha na diofar phàirtean de mitosis ag amas air atharrachaidhean ann am morf-eòlas mitochondrial, a dh’ fhaodadh a bhith nan crìochnachaidhean feumail de mhì-ghnìomhachd mitochondrial agus a bheir bunait airson sgrùdaidhean meacanaigeach às deidh sin.
Faodar morf-eòlas mitochondrial fhaicinn gu dìreach le bhith a’ cleachdadh microscopaidh dealanach tar-chuir (TEM), a’ leigeil le sgrùdadh mionaideach a dhèanamh air ultrastructar ceallach. Bidh TEM a’ dèanamh dealbh dìreach de morf-eòlas, cumadh agus structar cristae mitochondrial aig rùn mitochondria fa leth, seach a bhith an urra ri tar-sgrìobhadh gine, abairt pròtain no paramadairean gnìomh mitochondrial ann an sluagh cealla17,19,20. A bharrachd air an sin, bidh TEM a’ comasachadh sgrùdadh air eadar-obrachaidhean eadar mitochondria agus organelles eile, leithid an reticulum endoplasmic agus autophagosomes, a bhios a’ cluich prìomh dhleastanasan ann an gnìomh mitochondrial agus homeostasis21,22. Mar sin, tha seo a’ dèanamh TEM na dheagh àite tòiseachaidh airson mì-ghnìomhachd mitochondrial a sgrùdadh mus cuir thu fòcas air slighean no ginean sònraichte. Mar a bhios gnìomh mitochondrial a’ sìor fhàs buntainneach do neuropathology, tha feum soilleir ann a bhith comasach air morf-eòlas agus daineamaigs mitochondrial a sgrùdadh gu dìreach agus gu cainníomach ann am modalan neuronal in vitro.
San artaigil seo, bidh sinn a’ sgrùdadh daineamaigs mitochondrial ann am modail neuronal de mhì-ghnìomhachd mitochondrial ann an eas-òrdugh speactram autism. Roimhe seo, thug sinn cunntas air methylation eadar-dhealaichte de propionyl-CoA carboxylase beta (PCCB) ann an ASD15, fo-aonad den enzyme mitochondrial propionyl-CoA carboxylase PCC. Tha fios gu bheil mì-riaghladh PCC ag adhbhrachadh cruinneachadh puinnseanta de dh’fhuasglaidhean propionyl, a’ gabhail a-steach searbhag propionic (PPA)23,24,25. Chaidh a shealltainn gu bheil PPA a’ cur dragh air metabolism neuronal agus ag atharrachadh giùlan in vivo agus tha e na mhodail bheathach stèidhichte airson sgrùdadh a dhèanamh air uidheaman neuro-leasachaidh a tha an sàs ann an ASD26,27,28. A bharrachd air an sin, chaidh aithris gu bheil PPA a’ cur dragh air comas membran mitochondrial, biogenesis agus anail in vitro agus chaidh a chleachdadh gu farsaing gus modaladh a dhèanamh air mì-ghnìomhachd mitochondrial ann an neurons29,30. Ach, chan eil buaidh mì-ghnìomhachd mitochondrial air adhbhrachadh le PPA air morf-eòlas agus daineamaigs mitochondrial fhathast air a thuigsinn gu math.
Tha an sgrùdadh seo a’ cleachdadh dhòighean-obrach ìomhaighean co-phàirteach gus buaidh PPA air morf-eòlas, daineamaigs agus gnìomh mitochondrial ann an ceallan SH-SY5Y a thomhas. An toiseach, leasaich sinn dòigh TEM gus atharrachaidhean ann am morf-eòlas agus ultrastructure mitochondrial fhaicinn17,31,32. Leis cho daineamach ‘s a tha mitochondria33, chleachd sinn cuideachd mion-sgrùdadh localizer tachartais mitochondrial (MEL) gus atharrachaidhean anns a’ chothromachadh eadar tachartasan fission agus fusion, àireamh agus meud mitochondrial fo chuideam PPA a thomhas. Mu dheireadh, rinn sinn sgrùdadh a bheil morf-eòlas agus daineamaigs mitochondrial co-cheangailte ri atharrachaidhean ann an abairt ginean a tha an sàs ann am biogenesis, fission agus fusion. Còmhla, tha an dàta againn a’ sealltainn an dùbhlan a tha ann a bhith a’ soilleireachadh iom-fhillteachd nan dòighean-obrach a tha a’ riaghladh daineamaigs mitochondrial. Tha sinn a’ soilleireachadh goireasachd TEM ann a bhith a’ sgrùdadh morf-eòlas mitochondrial mar cheann-uidhe co-chruinneachaidh tomhaiste de mitosis ann an ceallan SH-SY5Y. A bharrachd air an sin, tha sinn a’ soilleireachadh gu bheil dàta TEM a’ toirt seachad an fhiosrachadh as beairtiche nuair a thèid an cur còmhla ri dòighean-obrach ìomhaighean a bhios cuideachd a’ glacadh tachartasan daineamach mar fhreagairt do chuideam metabolach. Dh’ fhaodadh tuilleadh comharrachadh air na dòighean-obrach riaghlaidh moileciuil a tha a’ toirt taic do mitosis cealla neuronal lèirsinn chudromach a thoirt seachad air pàirt mitochondrial an t-siostam nearbhach agus galairean neurodegenerative.
Gus cuideam mitochondrial a bhrosnachadh, chaidh ceallan SH-SY5Y a làimhseachadh le PPA a’ cleachdadh 3 mM agus 5 mM sodium propionate (NaP). Ro TEM, chaidh sampallan a chur fo ullachadh sampall criogenach a’ cleachdadh reothadh àrd-bhruthadh agus reothadh (Figear 1a). Leasaich sinn loidhne-phìoban mion-sgrùdaidh ìomhaigh mitochondrial fèin-ghluasadach gus ochd paramadairean morf-eòlach de shluagh mitochondrial a thomhas thar trì ath-aithrisean bith-eòlasach. Fhuair sinn a-mach gun do dh’ atharraich làimhseachadh PPA ceithir paramadairean gu mòr: farsaingeachd 2, farsaingeachd, cuairt-thomhas, agus trast-thomhas Feret (Figear 1b–e). Lùghdaich farsaingeachd 2 gu mòr le làimhseachadh PPA 3 mM agus 5 mM (p = 0.0183 agus p = 0.002, fa leth) (Figear 1b), agus tha farsaingeachd (p = 0.003), cuairt-thomhas (p = 0.0106) agus trast-thomhas Feret uile air lùghdachadh gu mòr. Bha lùghdachadh mòr ann (p = 0.0172) anns a’ bhuidheann làimhseachaidh 5 mM an taca ris a’ bhuidheann smachd (Figear 1c–e). Sheall lùghdachaidhean mòra ann an farsaingeachd agus cuairt-thomhas gu robh mitochondria nas lugha, nas cruinne aig ceallan air an làimhseachadh le 5 mM PPA, agus nach robh na mitochondria sin cho fada ri an fheadhainn ann an ceallan smachd. Tha seo cuideachd a’ co-chòrdadh ri lùghdachadh mòr ann an trast-thomhas Feret, paramadair neo-eisimeileach a’ nochdadh lùghdachadh anns an astar as motha eadar oirean mìrean. Chaidh atharrachaidhean fhaicinn ann an ultra-structar nan cristae: dh’fhàs na cristae nas lugha follaiseach fo bhuaidh cuideam PPA (Figear 1a, pannal B). Ach, cha robh a h-uile ìomhaigh a’ nochdadh ultra-structar nan cristae gu soilleir, agus mar sin cha deach mion-sgrùdadh cainneachdail air na h-atharrachaidhean sin a dhèanamh. Is dòcha gu bheil an dàta TEM seo a’ nochdadh trì suidheachaidhean a dh’ fhaodadh a bhith ann: (1) bidh PPA a’ neartachadh sgoltadh no a’ cur bacadh air co-aonadh, ag adhbhrachadh gum bi mitochondria a th’ ann mar-thà a’ crìonadh ann am meud; (2) bidh biogenesis nas fheàrr a’ cruthachadh mitochondria ùra, nas lugha no (3) a’ brosnachadh an dà dhòigh-obrach aig an aon àm. Ged nach urrainnear na cumhaichean sin aithneachadh le TEM, tha atharrachaidhean mòra morf-eòlach a’ nochdadh atharrachaidhean ann an homeostasis agus daineamaigs mitochondrial fo chuideam PPA. Às deidh sin, rinn sinn sgrùdadh air paramadairean a bharrachd gus na daineamaigs sin agus na dòighean-obrach a dh’ fhaodadh a bhith nam bunait a chomharrachadh nas fheàrr.
Bidh searbhag propionic (PPA) ag ath-dhealbhadh morf-eòlas mitochondrial. (a) Dealbhan riochdachail de mhicreasgopaidh dealanach tar-chuir (TEM) a’ sealltainn gu bheil meud mitochondrial a’ lùghdachadh agus mitochondria a’ fàs nas lugha agus nas cruinne le barrachd làimhseachaidh PPA; 0 mM (gun làimhseachadh), 3 mM agus 5 mM, fa leth. Tha saighdean dearga a’ comharrachadh mitochondria. (b–e) Chaidh ceallan SH-SY5Y a chaidh a làimhseachadh le PPA airson 24 uair ullachadh airson TEM agus chaidh na toraidhean a sgrùdadh a’ cleachdadh Fiji/ImageJ. Sheall ceithir de na h-ochd paramadairean eadar-dhealachaidhean mòra eadar ceallan smachd (gun làimhseachadh, 0 mM PPA) agus ceallan air an làimhseachadh (3 mM agus 5 mM PPA). (b) Roinn 2, (c) Farsaingeachd, (d) Iomall, (e) Trast-thomhas feret. Chaidh mion-sgrùdadh aon-shligheach air atharrachadh (smachd vs. làimhseachadh) agus deuchainn ioma-choimeas Dunnett a chleachdadh gus eadar-dhealachaidhean mòra a dhearbhadh (p <0.05). Tha puingean dàta a’ riochdachadh luach cuibheasach mitochondrial airson gach cealla fa leth, agus tha bàraichean mearachd a’ riochdachadh a’ chuibheasachd ± SEM. Tha an dàta a chithear a’ riochdachadh n = 3, co-dhiù 24 cealla gach ath-aithris; chaidh 266 ìomhaigh gu h-iomlan a sgrùdadh; Tha * a’ comharrachadh p < 0.05, tha ** a’ comharrachadh p < 0.01.
Gus tuilleadh dearbhaidh a dhèanamh air mar a bhios daineamaigs mitochondrial a’ freagairt ri PPA, dhath sinn mitochondria le tetramethylrhodamine ethyl ester (TMRE) agus chleachd sinn microscopy ùine-tuiteamach agus mion-sgrùdadh MEL gus mitochondria a lorg agus a thomhas an dèidh 24 uair aig 3 agus 5 mM PPA. Làimhseachadh thachartasan fiseadh is co-aonaidh. (Figear 2a). Às dèidh mion-sgrùdadh MEL, chaidh mion-sgrùdadh a dhèanamh air mitochondria tuilleadh gus àireamh nan structaran mitochondrial agus an tomhas-lìonaidh cuibheasach aca a thomhas. Chunnaic sinn àrdachadh beag ach cudromach ann an àireamh nan tachartasan fiseadh a thachair aig 3 mM [4.9 ± 0.3 (p < 0.05)] an taca ri fiseadh [5.6 ± 0.3 (p < 0.05))] agus co-aonadh [5.4 ± 0.5 (p < 0.05)] agus chaidh tachartasan co-aonaidh [5.4 ± 0.5 (p < 0.05)] 0.05)] <0.05)] a mheudachadh gu mòr aig 5 mM an taca ris a’ smachd (Figear 3b). Mheudaich àireamh nam mitochondria gu mòr aig an dà chuid 3 [32.6 ± 2.1 (p < 0.05)] agus 5 mM [34.1 ± 2.2 (p < 0.05)] (Figear 3c), agus dh’fhan meud cuibheasach gach structar mitochondrial gun atharrachadh (Figear 3c). 3d). Còmhla, tha seo a’ moladh gu bheil ath-mhodaileadh daineamaigs mitochondrial na fhreagairt dìolaidh a chumas suas ionracas an lìonra mitochondrial gu soirbheachail. Tha an àrdachadh ann an àireamh nan tachartasan fission aig 3 mM PPA a’ moladh gu bheil am àrdachadh ann an àireamh mitochondrial mar thoradh air fission mitochondrial gu ìre, ach leis gu bheil meud cuibheasach mitochondrial fhathast cha mhòr gun atharrachadh, chan urrainnear biogenesis a dhiùltadh mar fhreagairt dìolaidh a bharrachd. Ach, tha an dàta seo a rèir nan structaran mitochondrial nas lugha, cruinn a chithear le TEM agus tha iad cuideachd a’ sealltainn atharrachaidhean mòra ann an daineamaigs mitochondrial air an adhbhrachadh le PPA.
Bidh searbhag propionic (PPA) ag adhbhrachadh ath-dhealbhadh mitochondrial fiùghantach gus ionracas an lìonra a chumail suas. Chaidh ceallan SH-SY5Y a chultarachadh, an làimhseachadh le 3 agus 5 mM PPA airson 24 uair a thìde agus an dath le TMRE agus Hoechst 33342 agus an uairsin mion-sgrùdadh MEL. (a) Ìomhaighean maicreasgopaidh ùine-dhìolaidh riochdachail a’ sealltainn dath agus ro-mheasaidhean dian as àirde dà-chànanach aig àm 2 (t2) airson gach suidheachadh. Tha roinnean taghte a tha air an comharrachadh anns gach ìomhaigh dà-chànanach air an neartachadh agus air an taisbeanadh ann an 3D aig trì frèamaichean ùine eadar-dhealaichte (t1-t3) gus an daineamaigs thar ùine a nochdadh; tha tachartasan fusion air an comharrachadh ann an uaine; tha tachartasan fission air an comharrachadh ann an uaine. Air an taisbeanadh ann an dearg. (b) Àireamh chuibheasach de thachartasan fiùghantach gach suidheachadh. (c) Àireamh chuibheasach de structaran mitochondrial gach cealla. (d) Meud chuibheasach (µm3) de gach structar mitochondrial gach cealla. Tha an dàta a chithear a’ riochdachadh n = 15 ceallan gach buidheann làimhseachaidh. Tha na bàraichean mearachd a chithear a’ riochdachadh cuibheasachd ± SEM, bàr sgèile = 10 μm, * p < 0.05.
Bidh searbhag propionic (PPA) ag adhbhrachadh casg tar-sgrìobhaidh air ginean co-cheangailte ri daineamaigs mitochondrial. Chaidh ceallan SH-SY5Y a làimhseachadh le 3 agus 5 mM PPA airson 24 uair a thìde. Chaidh tomhas coimeasach gine a dhèanamh a’ cleachdadh RT-qPCR agus chaidh an gnàthachadh gu B2M. Ginean bith-ghineas mitochondrial (a) cMYC, (b) TFAM, (c) NRF1 agus (d) NFE2L2. Ginean fusion agus fission mitochondrial (e) STOML2, (f) OPA1, (g) MFN1, (h) MFN2 agus (i) DRP1. Chaidh eadar-dhealachaidhean cudromach (p < 0.05) a dhearbhadh a’ cleachdadh ANOVA aon-shligheach (smachd vs. làimhseachadh) agus deuchainn ioma-choimeas Dunnett: * a’ comharrachadh p < 0.05, ** a’ comharrachadh p < 0.01, agus **** a’ comharrachadh p < 0.0001. Tha na bàraichean a’ riochdachadh cuibheasachd abairt ± SEM. Tha an dàta a chithear a’ riochdachadh leth-bhreacan bith-eòlasach n = 3 (STOML2, OPA1, TFAM), n = 4 (cMYC, NRF1, NFE2L2), agus n = 5 (MFN1, MFN2, DRP1).
Tha dàta bho mhion-sgrùdaidhean TEM agus MEL còmhla a’ nochdadh gu bheil PPA ag atharrachadh morf-eòlas agus daineamaigs mitochondrial. Ach, chan eil na dòighean ìomhaighean seo a’ toirt sealladh air na dòighean bunaiteach a tha a’ stiùireadh nam pròiseasan sin. Mar sin, rinn sinn sgrùdadh air abairt mRNA naoi prìomh riaghladairean daineamaigs mitochondrial, biogenesis, agus mitosis mar fhreagairt do làimhseachadh PPA. Rinn sinn tomhas air oncogene myeloma cealla (cMYC), factar analach niùclasach (NRF1), factar tar-sgrìobhaidh mitochondrial 1 (TFAM), factar tar-sgrìobhaidh coltach ri NFE2 BZIP (NFE2L2), pròtain coltach ri gastrin 2 (STOML2), atrophy nerve optic 1 (OPA1), Mitofusin 1 (MFN1), Mitofusin 2 (MFN2) agus pròtain co-cheangailte ri dynamin 1 (DRP1) às deidh 24 uair a thìde de làimhseachadh le 3 mM agus 5 mM PPA. Chunnaic sinn làimhseachadh PPA 3 mM (p = 0.0053, p = 0.0415 agus p < 0.0001, fa leth) agus 5 mM (p = 0.0031, p = 0.0233, p < 0.0001). (Figear 3a–c). Bha an lùghdachadh ann an abairt mRNA an urra ris an dòs: lùghdaich abairt cMYC, NRF1 agus TFAM 5.7, 2.6 agus 1.9 uair aig 3 mM, fa leth, agus 11.2, 3 agus 2.2 uair aig 5 mM. An coimeas ri sin, cha deach atharrachadh a dhèanamh air a’ ghine biogenesis redox meadhanach NFE2L2 aig dùmhlachd sam bith de PPA, ged a chaidh gluasad coltach ris an dòs de lùghdachadh ann an abairt fhaicinn (Figear 3d).
Rinn sinn sgrùdadh cuideachd air mar a tha ginean clasaigeach a tha an sàs ann an riaghladh sgoltadh is co-aonadh air an cur an cèill. Thathas a’ creidsinn gu bheil STOML2 an sàs ann an co-aonadh, mitophagy agus biogenesis, agus chaidh an cur an cèill aige a lùghdachadh gu mòr (p < 0.0001) le 3 mM (atharrachadh 2.4-fhillte) agus 5 mM (atharrachadh 2.8-fhillte) PPA (Figear 1). 3d). San aon dòigh, chaidh cur an cèill gine co-aonadh OPA1 a lùghdachadh aig 3 mM (atharrachadh 1.6-fhillte) agus 5 mM (atharrachadh 1.9-fhillte) PPA (p = 0.006 agus p = 0.0024, fa leth) (Figear 3f). Ach, cha d’ fhuair sinn eadar-dhealachaidhean mòra ann an cur an cèill ginean co-aonadh MFN1, MFN2 no gine sgoltadh DRP1 fo chuideam PPA 24-uair (Figear 3g–i). A bharrachd air an sin, fhuair sinn a-mach nach do dh’atharraich ìrean ceithir phròtainean co-aonaidh is sgoltadh (OPA1, MFN1, MFN2 agus DRP1) fo na h-aon chumhachan (Figear 4a–d). Tha e cudromach a thoirt fa-near gu bheil an dàta seo a’ nochdadh aon phuing ann an tìm agus is dòcha nach eil e a’ nochdadh atharrachaidhean ann an abairt pròtain no ìrean gnìomhachd rè ìrean tràtha cuideam PPA. Ach, tha lùghdachaidhean mòra ann an abairt cMYC, NRF1, TFAM, STOML2, agus OPA1 a’ nochdadh mì-riaghladh tar-sgrìobhaidh mòr air metabolism mitochondrial, biogenesis, agus daineamaigs. A bharrachd air an sin, tha an dàta seo a’ soilleireachadh cho feumail sa tha dòighean ìomhaighean gus sgrùdadh dìreach a dhèanamh air atharrachaidhean staid deireannach ann an gnìomh mitochondrial.
Cha do dh’atharraich ìrean pròtain factar co-aonaidh agus fission às dèidh làimhseachadh le searbhag propionic (PPA). Chaidh ceallan SH-SY5Y a làimhseachadh le PPA 3 agus 5 mM airson 24 uair a thìde. Chaidh ìrean pròtain a thomhas le mion-sgrùdadh blot Western, agus chaidh na h-ìrean abairteachd a dhèanamh àbhaisteach gu pròtain iomlan. Tha cuibheasachd abairteachd pròtain agus blots Western riochdachail de phròtain targaid agus iomlan air an sealltainn. a – OPA1, b – MFN1, c – MFN2, d – DRP1. Tha na bàraichean a’ riochdachadh a’ chuibheasachd ± SEM, agus tha an dàta a chithear a’ riochdachadh n = 3 leth-bhreacan bith-eòlasach. Chaidh coimeasan ioma-fhillte (p < 0.05) a dhèanamh a’ cleachdadh mion-sgrùdadh aon-shligheach air atharrachaidh agus deuchainn Dunnett. Tha an gel agus am blot tùsail air an sealltainn ann am Figear S1.
Tha mì-ghnìomhachd mitochondrial co-cheangailte ri galairean ioma-shiostamach a’ dol bho ghalaran metabolach, cardiovascular agus fèitheach gu galairean neurolach1,10. Tha mòran ghalaran neurodegenerative agus neurodegenerative co-cheangailte ri mì-ghnìomhachd mitochondrial, a’ cur cuideam air cho cudromach sa tha na h-organelles sin fad beatha na h-eanchainn. Tha na galairean sin a’ toirt a-steach galar Pharkinson, galar Alzheimer agus ASD3,4,18. Ach, tha e duilich faighinn gu clò eanchainn gus na galairean sin a sgrùdadh, gu sònraichte aig an ìre meacanaigeach, a’ dèanamh siostaman modail ceallach nan roghainn eile riatanach. Anns an sgrùdadh seo, bidh sinn a’ cleachdadh siostam modail ceallach a’ cleachdadh ceallan SH-SY5Y air an làimhseachadh le PPA gus an mì-ghnìomhachd mitochondrial a chithear ann an galairean neuronal, gu sònraichte eas-òrdughan speactram autism, ath-aithris. Dh’ fhaodadh gum bi cleachdadh a’ mhodail PPA seo gus sgrùdadh a dhèanamh air daineamaigs mitochondrial ann an neurons a’ toirt sealladh dhuinn air etiology ASD.
Rinn sinn sgrùdadh air a’ chomas TEM a chleachdadh gus atharrachaidhean ann am morf-eòlas mitochondrial fhaicinn. Tha e cudromach a thoirt fa-near gum feumar TEM a chleachdadh gu ceart gus a èifeachdas a mheudachadh. Le bhith ag ullachadh crio-shampallan, faodar structaran neuronal a ghleidheadh ​​nas fheàrr le bhith a’ daingneachadh phàirtean ceallach agus a’ lughdachadh cruthachadh artifacts aig an aon àm34. A rèir seo, mhothaich sinn gu robh organelles fo-cheallach slàn agus mitochondria fada aig ceallan SH-SY5Y coltach ri neuron (Figear 1a). Tha seo a’ soilleireachadh cho feumail sa tha dòighean ullachaidh criogenach airson sgrùdadh a dhèanamh air morf-eòlas mitochondrial ann am modalan cealla neuronal. Ged a tha tomhasan cainneachdail deatamach airson mion-sgrùdadh oibiaigteach air dàta TEM, chan eil co-aontachd ann fhathast air dè na paramadairean sònraichte a bu chòir a thomhas gus atharrachaidhean morf-eòlach mitochondrial a dhearbhadh. Stèidhichte air àireamh mhòr de sgrùdaidhean a tha air sgrùdadh cainneachdail a dhèanamh air morf-eòlas mitochondrial17,31,32, leasaich sinn loidhne-phìoban mion-sgrùdaidh ìomhaigh mitochondrial fèin-ghluasadach a bhios a’ tomhas ochd paramadairean morf-eòlach, is iad sin: farsaingeachd, farsaingeachd2, co-mheas taobh, iomall, cuairteachadh, ceum, trast-thomhas Feret. agus cruinn.
Nam measg, lughdaich PPA gu mòr farsaingeachd 2, farsaingeachd, cuairt-thomhas, agus trast-thomhas Feret (Figear 1b–e). Sheall seo gun robh mitochondria air fàs nas lugha agus nas cruinne, a tha a rèir sgrùdaidhean roimhe a’ sealltainn lùghdachadh ann an farsaingeachd mitochondrial às deidh 72 uair de chuideam mitochondrial air adhbhrachadh le PPA30. Is dòcha gu bheil na feartan morf-eòlach seo a’ nochdadh fission mitochondrial, pròiseas riatanach gus co-phàirtean millte a sgaradh bhon lìonra mitochondrial gus an crìonadh adhartachadh tro mitophagy35,36,37. Air an làimh eile, is dòcha gu bheil an lùghdachadh ann am meud cuibheasach mitochondrial co-cheangailte ri barrachd biogenesis, a tha ag adhbhrachadh cruthachadh mitochondria beaga nascent. Tha barrachd fission no biogenesis a’ riochdachadh freagairt dìolaidh gus mitosis a chumail suas an aghaidh cuideam mitochondrial. Ach, chan urrainnear fàs mitochondrial nas lugha, aonadh lag, no cumhaichean eile a dhùnadh a-mach.
Ged a leigeas na h-ìomhaighean àrd-rèiteachaidh a chruthaich TEM le bhith a’ dearbhadh feartan moirfeòlais aig ìre mitochondria fa leth, bidh an dòigh seo a’ toirt a-mach dealbhan-sgrìn dà-thaobhach aig aon àm. Gus freagairtean fiùghantach do chuideam metabolach a sgrùdadh, dhath sinn mitochondria le TMRE agus chleachd sinn microscopaidh ùine-tuiteam le mion-sgrùdadh MEL, a leigeas le lèirsinn 3D àrd-toraidh de atharrachaidhean anns an lìonra mitochondrial thar ùine33,38. Chunnaic sinn atharrachaidhean beaga ach cudromach ann an daineamaigs mitochondrial fo chuideam PPA (Figear 2). Aig 3 mM, mheudaich an àireamh de thachartasan fission gu mòr, agus dh’fhan tachartasan fusion mar an ceudna ris an smachd. Chaidh àrdachadh fhaicinn ann an àireamh an dà chuid tachartasan fission agus fusion aig 5 mM PPA, ach bha na h-atharrachaidhean sin gu ìre mhath co-rèireach, a’ moladh gun ruig cineatics fission agus fusion cothromachadh aig dùmhlachdan nas àirde (Figear 2b). Dh’fhan meud cuibheasach mitochondrial gun atharrachadh aig 3 agus 5 mM PPA, a’ nochdadh gun deach ionracas an lìonra mitochondrial a ghleidheadh ​​(Figear 2d). Tha seo a’ nochdadh comas lìonraidhean mitochondrial fiùghantach freagairt a thoirt do chuideam metabolach tlàth gus homeostasis a chumail suas gu h-èifeachdach gun a bhith ag adhbhrachadh briseadh lìonra. Aig 3 mM PPA, tha an àrdachadh ann an sgoltadh gu leòr gus gluasad gu cothromachadh ùr adhartachadh, ach tha feum air ath-mhodaileadh cineatach nas doimhne mar fhreagairt do chuideam air adhbhrachadh le dùmhlachdan nas àirde de PPA.
Mheudaich àireamh nam mitochondria aig an dà chuid dùmhlachd cuideam PPA, ach cha do dh’atharraich meud cuibheasach mitochondrial gu mòr (Figear 2c). Dh’fhaodadh seo a bhith mar thoradh air barrachd biogenesis no barrachd roinneadh; ge-tà, mura h-eil lùghdachadh mòr ann am meud cuibheasach mitochondrial, tha e nas coltaiche gum bi biosynthesis ag àrdachadh. Ach, tha an dàta ann am Figear 2 a’ toirt taic do dhà dhòigh-obrach dìolaidh: àrdachadh ann an àireamh thachartasan fission, a rèir àrdachadh fission mitochondrial, agus àrdachadh ann an àireamh thachartasan, a rèir biogenesis mitochondrial. Mu dheireadh, faodaidh dìoladh fiùghantach airson cuideam tlàth a bhith air a dhèanamh suas de phròiseasan aig an aon àm anns a bheil fission, fusion, biogenesis, agus mitophagy. Ged a tha ùghdaran roimhe air sealltainn gu bheil PPA a’ neartachadh mitosis30,39 agus mitophagy29, tha sinn a’ toirt seachad fianais airson ath-dhealbhadh daineamaigs fission agus fusion mitochondrial mar fhreagairt do PPA. Tha an dàta seo a’ dearbhadh nan atharrachaidhean morf-eòlach a chithear le TEM agus a’ toirt seachad tuilleadh lèirsinn air na dòighean-obrach co-cheangailte ri mì-ghnìomhachd mitochondrial air adhbhrachadh le PPA.
Leis nach tug mion-sgrùdadh TEM no MEL fianais dhìreach air na dòighean riaghlaidh gine a bha aig bonn nan atharrachaidhean morf-eòlach a chaidh fhaicinn, rinn sinn sgrùdadh air abairt RNA ginean a tha an sàs ann am metabolism mitochondrial, biogenesis, agus daineamaigs. Tha am proto-oncogene cMYC na fhactar tar-sgrìobhaidh a tha an sàs ann an riaghladh mitochondria, glycolysis, metabolism amino-aigéid agus searbhag geir40. A bharrachd air an sin, tha fios gu bheil cMYC a’ riaghladh abairt faisg air 600 gine mitochondrial a tha an sàs ann an tar-sgrìobhadh mitochondrial, eadar-theangachadh, agus cruinneachadh iom-fhillte, nam measg NRF1 agus TFAM41. Tha NRF1 agus TFAM nan dà phrìomh riaghlaiche mitosis, ag obair sìos an abhainn bho PGC-1α gus ath-riochdachadh mtDNA a ghnìomhachadh. Tha an t-slighe seo air a ghnìomhachadh le comharran cAMP agus AMPK agus tha e mothachail air caiteachas lùtha agus cuideam metabolach. Rinn sinn sgrùdadh cuideachd air NFE2L2, riaghlaiche redox de biogenesis mitochondrial, gus faighinn a-mach an gabhadh buaidhean PPA a mheadhanachadh le cuideam oxidative.
Ged nach do dh’atharraich abairt NFE2L2, fhuair sinn lùghdachadh cunbhalach a rèir an dòs ann an abairt cMYC, NRF1 agus TFAM an dèidh 24 uair de làimhseachadh le 3 mM agus 5 mM PPA (Figear 3a–c). Chaidh aithris roimhe seo air lùghdachadh abairt cMYC mar fhreagairt do chuideam mitochondrial42, agus air an làimh eile, faodaidh lùghdachadh abairt cMYC mì-ghnìomhachd mitochondrial adhbhrachadh le bhith ag ath-dhealbhadh metabolism mitochondrial, ceangal lìonra, agus polarachadh membran43. Gu inntinneach, tha cMYC cuideachd an sàs ann an riaghladh sgoltadh agus fusion mitochondrial42,43 agus tha fios gu bheil e ag àrdachadh fosfaraileadh DRP1 agus suidheachadh mitochondrial rè roinneadh cealla44, a bharrachd air ath-dhealbhadh morf-eòlach mitochondrial ann an ceallan gas neuronal45. Gu dearbh, tha fibroblasts easbhaidheach cMYC a’ nochdadh meud mitochondrial nas lugha, a rèir atharrachaidhean air adhbhrachadh le cuideam PPA43. Tha an dàta seo a’ nochdadh dàimh inntinneach ach fhathast mì-shoilleir eadar cMYC agus daineamaigs mitochondrial, a’ toirt seachad targaid inntinneach airson sgrùdaidhean san àm ri teachd air ath-dhealbhadh air adhbhrachadh le cuideam PPA.
Tha lùghdachadh NRF1 agus TFAM a rèir dreuchd cMYC mar ghnìomhaiche tar-sgrìobhaidh cudromach. Tha an dàta seo cuideachd a rèir sgrùdaidhean a rinneadh roimhe ann an ceallan aillse coloin daonna a’ sealltainn gun do lughdaich PPA abairt mRNA NRF1 aig 22 uair a thìde, a bha co-cheangailte ri crìonadh ATP agus àrdachadh ROS46. Dh’innis na h-ùghdaran seo cuideachd gun do dh’àrdaich abairt TFAM aig 8.5 uair a thìde ach gun do thill e gu ìrean bunaiteach aig 22 uair a thìde. An coimeas ri sin, sheall Kim et al. (2019) gun robh abairt mRNA TFAM air a lùghdachadh gu mòr às deidh 4 uairean a thìde de chuideam PPA ann an ceallan SH-SY5Y; ge-tà, às deidh 72 uair a thìde, bha abairt pròtain TFAM air a mheudachadh gu mòr agus bha àireamh leth-bhreac mtDNA air a mheudachadh gu mòr. Mar sin, chan eil an lùghdachadh ann an àireamh nan ginean biogenesis mitochondrial a chunnaic sinn às deidh 24 uair a thìde a’ dùnadh a-mach a’ chomas gu bheil an àrdachadh ann an àireamh nam mitochondria co-cheangailte ri gnìomhachadh biogenesis aig puingean ùine nas tràithe. Tha sgrùdaidhean a rinneadh roimhe air sealltainn gu bheil PPA ag àrdachadh mRNA agus pròtain PGC-1α gu mòr ann an ceallan SH-SY5Y aig 4 uairean 30 mionaid, agus gu bheil searbhag propionic a’ neartachadh biogenesis mitochondrial ann an hepatocytes laoigh tro PGC-1α aig 12 uairean 39 mionaid. Gu inntinneach, chan e a-mhàin gu bheil PGC-1α na riaghlaiche tar-sgrìobhaidh dìreach de NRF1 agus TFAM, ach chaidh a shealltainn cuideachd gu bheil e a’ riaghladh gnìomhachd MFN2 agus DRP1 le bhith a’ riaghladh fission agus fusion47. Còmhla, tha seo a’ soilleireachadh an ceangal dlùth eadar uidheaman a bhios a’ riaghladh freagairtean dìolaidh mitochondrial air an adhbhrachadh le PPA. A bharrachd air an sin, tha an dàta againn a’ nochdadh mì-riaghladh mòr air riaghladh tar-sgrìobhaidh biogenesis agus metabolism fo chuideam PPA.
Tha na ginean STOML2, OPA1, MFN1, MFN2 agus DRP1 am measg nam prìomh riaghladairean air sgoltadh, co-aonadh agus daineamaigs mitochondrial37,48,49. Tha mòran ghinean eile an sàs ann an daineamaigs mitochondrial, ge-tà, chaidh STOML2, OPA1 agus MFN2 a lorg roimhe seo gu bheil iad air am meitileachadh gu eadar-dhealaichte ann an cohorts ASD,16 agus tha grunn sgrùdaidhean neo-eisimeileach air atharrachaidhean aithris anns na factaran tar-sgrìobhaidh seo mar fhreagairt do chuideam mitochondrial50,51.52. Chaidh abairt an dà chuid OPA1 agus STOML2 a lùghdachadh gu mòr le làimhseachadh PPA 3 mM agus 5 mM (Figear 3e, f). Tha OPA1 mar aon de na riaghladairean clasaigeach air co-aonadh mitochondrial tro eadar-obrachadh dìreach le MFN1 agus 2 agus tha pàirt aige ann an ath-dhealbhadh cristae agus morf-eòlas mitochondrial53. Tha dreuchd cheart STOML2 ann an daineamaigs mitochondrial fhathast mì-shoilleir, ach tha fianais a’ moladh gu bheil pàirt aige ann an co-aonadh mitochondrial, biogenesis, agus mitophagy.
Tha STOML2 an sàs ann a bhith a’ cumail suas ceangal analach mitochondrial agus cruthachadh iom-fhilltean slabhraidh analach54,55 agus chaidh a shealltainn gu bheil e ag atharrachadh feartan metabolach cheallan aillse gu mòr56. Tha sgrùdaidhean air sealltainn gu bheil STOML2 a’ brosnachadh comas membran mitochondrial agus biogenesis tro eadar-obrachadh le BAN agus cardiolipin 55, 57, 58. A bharrachd air an sin, tha sgrùdaidhean neo-eisimeileach air sealltainn gu bheil an eadar-obrachadh eadar STOML2 agus PINK1 a’ riaghladh mitophagy59,60. Gu sònraichte, chaidh aithris gu bheil STOML2 ag eadar-obrachadh gu dìreach le MFN2 agus ga dhaingneachadh agus cuideachd a’ cluich pàirt chudromach ann a bhith a’ daingneachadh isoforms fada OPA1 le bhith a’ cur bacadh air a’ protease a tha an urra ri lobhadh OPA153,61,62. Dh’ fhaodadh an lùghdachadh ann an abairt STOML2 a chithear ann an ath-bheachdan PPA na pròtainean fusion sin a dhèanamh nas buailtiche do lobhadh tro shlighean an urra ri ubiquitin agus proteasome48. Ged nach eil dreuchd shònraichte STOML2 agus OPA1 anns an fhreagairt dhinimigeach do PPA soilleir, dh’ fhaodadh lùghdachadh ann an abairt nan ginean co-aonaidh seo (Figear 3) an cothromachadh eadar sgoltadh agus co-aonadh a bhriseadh agus leantainn gu lùghdachadh ann am meud mitochondrial (Figear 3). 1).
Air an làimh eile, dh’fhan abairt pròtain OPA1 gun atharrachadh às dèidh 24 uair, agus cha do dh’atharraich ìrean mRNA agus pròtain MFN1, MFN2 no DRP1 gu mòr às dèidh làimhseachadh PPA (Figear 3g-i, Figear 4). Dh’fhaodadh seo a bhith a’ nochdadh nach eil atharrachaidhean sam bith ann an riaghladh nan nithean sin a tha an sàs ann an co-aonadh agus sgoltadh mitochondrial. Ach, is fhiach a thoirt fa-near gu bheil gach aon de na ceithir ginean sin cuideachd air a riaghladh le atharrachaidhean iar-sgrìobhaidh (PTMn) a bhios a’ cumail smachd air gnìomhachd pròtain. Tha ochd atharrachaidhean splice eile aig OPA1 a tha air an sgoltadh gu proteolytic ann am mitochondria gus dà isoform eadar-dhealaichte a thoirt gu buil 63. Tha an cothromachadh eadar isoforms fada agus goirid a’ dearbhadh mu dheireadh dreuchd OPA1 ann an co-aonadh mitochondrial agus cumail suas lìonra mitochondrial 64. Tha gnìomhachd DRP1 air a riaghladh le fosfaireachadh kinase pròtain II a tha an urra ri calcium / calmodulin (CaMKII), agus tha lobhadh DRP1 air a riaghladh le ubiquitination agus SUMOylation 65. Mu dheireadh, tha an dà chuid DRP1 agus MFN1/2 nan GTPases, agus mar sin dh’ fhaodadh ìre cinneasachadh GTP ann am mitochondria buaidh a thoirt air gnìomhachd 66. Mar sin, ged a tha an ìre de ghnìomhachd nam pròtainean sin seasmhach, is dòcha nach eil seo a’ nochdadh gnìomhachd no suidheachadh pròtain gun atharrachadh 67,68. Gu dearbh, bidh clàran-pròtain PTM a th’ ann mar-thà gu tric a’ frithealadh mar a’ chiad loidhne dìon a tha an urra ri bhith a’ meadhanachadh freagairtean cuideam géar. Ma tha cuideam metabolach meadhanach anns a’ mhodail againn, tha e coltach gum bi PTM a’ brosnachadh barrachd gnìomhachd phròtainean co-aonaidh is sgoltadh gus ionracas mitochondrial ath-nuadhachadh gu leòr gun a bhith feumach air barrachd gnìomhachaidh de na ginean sin aig ìre mRNA no pròtain.
Còmhla, tha an dàta gu h-àrd a’ soilleireachadh cho iom-fhillte agus a tha an urra ri ùine riaghladh morf-eòlas mitochondrial agus na dùbhlain a tha an lùib na dòighean sin a shoilleireachadh. Gus sgrùdadh a dhèanamh air gnìomhachd gine, tha e riatanach an toiseach ginean targaid sònraichte a chomharrachadh anns an t-slighe. Ach, tha an dàta againn a’ sealltainn nach eil ginean san aon shlighe a’ freagairt san aon dòigh ris an aon cuideam. Gu dearbh, tha sgrùdaidhean roimhe air sealltainn gum faod diofar ghinean san aon shlighe pròifilean freagairt ùineail eadar-dhealaichte a nochdadh30,46. A bharrachd air an sin, tha dòighean iar-sgrìobhaidh iom-fhillte ann a chuireas dragh air a’ cheangal eadar tar-sgrìobhadh agus gnìomh gine. Faodaidh sgrùdaidhean proteomic sealladh a thoirt seachad air buaidh PTMn agus gnìomh pròtain, ach tha iad cuideachd a’ cur dùbhlain an sàs, a’ gabhail a-steach dòighean ìosal-toraidh, co-mheasan àrda comharra-gu-fuaim, agus droch rùn.
Anns a’ cho-theacsa seo, tha comas mòr aig sgrùdadh morf-eòlas mitochondrial a’ cleachdadh TEM agus MEL gus dèiligeadh ri ceistean bunaiteach mun cheangal eadar daineamaigs agus gnìomh mitochondrial agus mar a bheir seo buaidh air galair. Nas cudromaiche, tha TEM a’ toirt seachad dòigh dhìreach airson morf-eòlas mitochondrial a thomhas mar cheann-uidhe co-chruinneachaidh de mhì-ghnìomhachd agus daineamaigs mitochondrial51. Tha MEL cuideachd a’ toirt seachad dòigh dhìreach airson tachartasan fission agus fusion a dhèanamh follaiseach ann an àrainneachd cheallach trì-thaobhach, a’ leigeil le ath-dhealbhadh mitochondrial fiùghantach a thomhas eadhon ged nach eil atharrachaidhean ann an abairt gine33. An seo tha sinn a’ soilleireachadh cho feumail sa tha dòighean ìomhaighean mitochondrial ann an galairean mitochondrial àrd-sgoile. Mar as trice tha na galairean sin air an comharrachadh le cuideam metabolach tlàth leantainneach air a chomharrachadh le ath-dhealbhadh seòlta de lìonraidhean mitochondrial seach milleadh mitochondrial géar. Ach, tha builean gnìomh domhainn aig an dìoladh mitochondrial a tha a dhìth gus mitosis a chumail suas fo chuideam leantainneach. Ann an co-theacsa neuro-saidheans, faodaidh tuigse nas fheàrr air na dòighean dìolaidh sin fiosrachadh cudromach a thoirt seachad mun neuropathology pleiotropic co-cheangailte ri mì-ghnìomhachd mitochondrial.
Mu dheireadh, tha an dàta againn a’ soilleireachadh cho feumail sa tha dòighean ìomhaighean airson tuigse fhaighinn air builean gnìomhach nan eadar-obrachaidhean iom-fhillte eadar abairt gine, atharrachaidhean pròtain, agus gnìomhachd pròtain a bhios a’ cumail smachd air daineamaigs mitochondrial neuronal. Chleachd sinn PPA gus modaladh a dhèanamh de mhì-ghnìomhachd mitochondrial ann am modail cealla neuronal gus lèirsinn fhaighinn air a’ phàirt mitochondrial de ASD. Sheall ceallan SH-SY5Y air an làimhseachadh le PPA atharrachaidhean ann am morf-eòlas mitochondrial: dh’fhàs mitochondria beag agus cruinn, agus bha cristae air am mìneachadh gu dona nuair a chaidh am faicinn le TEM. Tha mion-sgrùdadh MEL a’ sealltainn gu bheil na h-atharrachaidhean sin a’ tachairt aig an aon àm ri àrdachadh ann an tachartasan fission agus fusion gus an lìonra mitochondrial a chumail suas mar fhreagairt do chuideam metabolach tlàth. A bharrachd air an sin, tha PPA a’ cur dragh mòr air riaghladh tar-sgrìobhaidh metabolism mitochondrial agus homeostasis. Chomharraich sinn cMYC, NRF1, TFAM, STOML2, agus OPA1 mar phrìomh riaghladairean mitochondrial air an cur às le cuideam PPA agus is dòcha gu bheil pàirt aca ann a bhith a’ meadhanachadh atharrachaidhean air adhbhrachadh le PPA ann am morf-eòlas agus gnìomh mitochondrial. Tha feum air sgrùdaidhean san àm ri teachd gus atharrachaidhean sealach air adhbhrachadh le PPA ann an abairt gine agus gnìomhachd pròtain, suidheachadh, agus atharrachaidhean iar-eadar-theangachaidh a chomharrachadh nas fheàrr. Tha an dàta againn a’ soilleireachadh iom-fhillteachd agus eadar-eisimeileachd nan uidheaman riaghlaidh a tha a’ meadhanachadh freagairt cuideam mitochondrial agus a’ sealltainn cho feumail ‘s a tha TEM agus dòighean ìomhaighean eile airson sgrùdaidhean meacanaigeach nas cuimsichte.
Chaidh an loidhne-chealla SH-SY5Y (ECACC, 94030304-1VL) a cheannach bho Sigma-Aldrich. Chaidh ceallan SH-SY5Y fhàs ann am measgachadh beathachaidh meadhan/F-12 atharraichte Dulbecco aig Eagle (DMEM/F-12) agus L-glutamine (SC09411, ScienCell) ann am flasgaichean 25 cm2 le 20% serum fetal bovine (FBS) (10493106, ThermoFisher Scientific) agus 1% penicillin-streptomycin (P4333-20ML, Sigma-Aldrich) aig 37 °C, 5% CO2. Chaidh na ceallan ath-chultarachadh gu 80% de cho-shruthadh a’ cleachdadh 0.05% trypsin-EDTA (15400054, ThermoFisher Scientific), air an cur ann an centrifuge aig 300 g agus air an cur ann am pleitean aig dùmhlachd de mu 7 × 105 ceallan/ml. Chaidh a h-uile deuchainn a dhèanamh air ceallan SH-SY5Y neo-eadar-dhealaichte eadar slighean 19–22. Tha PPA air a rianachd mar NaP. Leagh pùdar NaP (Àireamh CAS 137-40-6, foirmle cheimigeach C3H5NaO2, P5436-100G, Sigma-Aldrich) ann an uisge blàth MilliQ gu dùmhlachd de 1 M agus stòraich aig 4 °C. Air latha an làimhseachaidh, caolaich am fuasgladh seo le 1 M PPA gu 3 mM agus 5 mM PPA ann am meadhan saor bho serum (DMEM/F-12 le L-glutamine). B’ e dùmhlachdan làimhseachaidh airson a h-uile deuchainn gun PPA (0 mM, smachd), 3 mM, agus 5 mM PPA. Chaidh deuchainnean a dhèanamh ann an co-dhiù trì leth-bhreacan bith-eòlasach.
Chaidh ceallan SH-SY5Y a chur ann am flasgaichean 25 cm5 aig ìre de 5.5 × 105 ceallan/ml agus chaidh an fhàs airson 24 uairean. Chaidh an làimhseachadh PPA a chur ris a’ fhlasg mus deach 24 uair a thìde de ghoir a ghabhail. Cruinnich peileagan cealla a’ leantainn phròtacalan àbhaisteach fo-chultar clò mhamaileach (air am mìneachadh gu h-àrd). Ath-fhuadaich am peileag cealla ann an 100 µl 2.5% glutaraldehyde, 1× PBS agus stòraich aig 4 °C gus an deach a phròiseasadh. Chaidh ceallan SH-SY5Y a chuir ann an centrifuge goirid gus na ceallan a dhèanamh ann am peileagan agus fuasgladh 2.5% glutaraldehyde, 1× PBS a thoirt air falbh. Ath-fhuadaich an grùid ann an gel agarose 4% air ullachadh ann an uisge grùide (is e 1:1 an co-mheas eadar agarose agus meud grùid). Chaidh pìosan agarose a chur air greideal air truinnsearan rèidh agus chaidh an còmhdach le 1-hexadecene mus deach an reothadh fo chuideam àrd. Chaidh sampallan a reothadh ann an 100% acetone tioram aig -90 °C airson 24 uairean. Chaidh an teòthachd an uair sin àrdachadh gu -80°C agus chaidh fuasgladh de 1% osmium tetroxide agus 0.1% glutaraldehyde a chur ris. Chaidh sampallan a stòradh aig -80°C airson 24 uairean. Às dèidh seo, chaidh an teòthachd àrdachadh mean air mhean gu teòthachd an t-seòmair thar grunn làithean: bho – 80 °C gu – 50 °C airson 24 uairean, gu – 30 °C airson 24 uairean, gu – 10 °C airson 24 uairean agus mu dheireadh gu teòthachd an t-seòmair.
Às dèidh ullachadh criogenach, chaidh na sampallan a bogadh ann an roisinn agus chaidh earrannan tana gu math (∼100 nm) a dhèanamh a’ cleachdadh ultramicrotome Leica Reichert UltracutS (Leica Microsystems). Chaidh na h-earrannan a dhath le 2% uranyl acetate agus luaidhe citrate. Chaidh na sampallan fhaicinn a’ cleachdadh miocroscop tar-chuir dealanach FEI Tecnai 20 (ThermoFisher (roimhe seo FEI), Eindhoven, Na Tìrean Ìsle) ag obrachadh aig 200 kV (tar-chuir Lab6) agus camara CCD Gatan (Gatan, RA) uidheamaichte le criathrag lùtha Tridiem.
Anns gach mac-samhail theicnigeach, chaidh co-dhiù 24 ìomhaigh cealla singilte fhaighinn, airson 266 ìomhaigh gu h-iomlan. Chaidh na h-ìomhaighean uile a sgrùdadh a’ cleachdadh macro Roinn Ùidh (ROI) agus macro Mitochondria. Tha am macro mitochondrial stèidhichte air dòighean foillsichte17,31,32 agus leigidh e le giullachd baidse leth-fèin-ghluasadach de dhealbhan TEM ann am Fiji/ImageJ69. Ann an ùine ghoirid: tha an ìomhaigh air a h-aiseag agus air a h-aiseag le bhith a’ cleachdadh toirt air falbh cùl-raon ball rollaidh (radius 60 piogsail) agus criathrag bandpass FFT (a’ cleachdadh crìochan àrda is ìosal 60 agus 8 piogsail fa leth) agus casg loidhne dhìreach le fulangas treòrachaidh de 5%. Tha an ìomhaigh air a giullachd air a stairsnich gu fèin-ghluasadach a’ cleachdadh algairim entropy as àirde agus tha masg dà-chànanach air a chruthachadh. Chaidh roinnean ìomhaigh co-cheangailte ri ROIan a chaidh a thaghadh le làimh ann an ìomhaighean TEM amh a thoirt a-mach, a’ comharrachadh mitochondria agus a’ fàgail a-mach an membran plasma agus roinnean àrd-eadar-dhealachaidh eile. Airson gach ROI a chaidh a thoirt a-mach, chaidh mion-sgrùdadh a dhèanamh air mìrean dà-chànanach nas motha na 600 piogsail, agus chaidh farsaingeachd, cuairt-thomhas, aiseil mhòra is bheaga, trast-thomhas Feret, cruinn-chruth, agus cearcallachd nam mìrean a thomhas a’ cleachdadh nan gnìomhan tomhais togte aig Fiji/ImageJ. A’ leantainn Merrill, Flippo, agus Strack (2017), chaidh farsaingeachd 2, co-mheas taobh nam mìrean (co-mheas aiseil mhòr ri aiseil bheag), agus am factar cumadh (FF) obrachadh a-mach bhon dàta seo, far a bheil FF = cuairt-thomhas 2/4pi x farsaingeachd. Gheibhear mìneachadh na foirmle paraimeadrach ann am Merrill, Flippo, agus Strack (2017). Tha na macraichean a chaidh ainmeachadh rim faighinn air GitHub (faic Aithris Ruigsinneachd Dàta). Gu cuibheasach, chaidh timcheall air 5,600 mìrean a sgrùdadh gach làimhseachadh PPA, airson timcheall air 17,000 mìrean gu h-iomlan (dàta gun a shealltainn).
Chaidh ceallan SH-SH5Y a chur ann an soithichean cultar 8-seòmar (ThermoFisher, #155411) gus leigeil leotha greamachadh thar oidhche agus an uairsin chaidh an goradh le TMRE 1:1000 (ThermoFisher, #T669) agus Hoechst 33342 1:200 (Sigma-Aldrich, H6024). dathadh. Chaidh ìomhaighean fhaighinn le bhith a’ cleachdadh lasers 405 nm agus 561 nm thairis air àrainneachd 10 mionaidean, agus chaidh ìomhaighean amh fhaighinn mar z-stacan anns an robh 10 micrografan ìomhaigh le ceum az de 0.2 μm eadar frèamaichean ìomhaigh aig 12 puingean-ama às deidh sin. Chaidh ìomhaighean a chruinneachadh le bhith a’ cleachdadh àrd-ùrlar sàr-rùn Carl Zeiss LSM780 ELYRA PS.1 (Carl Zeiss, Oberkochen, a’ Ghearmailt) a’ cleachdadh lionsa LCI Plan Apochromate 100x/1.4 Oil DIC M27. Chaidh ìomhaighean a sgrùdadh ann an ImageJ a’ cleachdadh loidhne-phìoban a chaidh a mhìneachadh roimhe agus am plugan ImageJ gus tachartasan co-aonaidh is sgoltadh a thomhas, àireamh chuibheasach de structaran mitochondrial, agus meud mitochondrial cuibheasach gach cealla33. Tha macros MEL rim faighinn air GitHub (faic Aithris Ruigsinneachd Dàta).
Chaidh ceallan SH-SY5Y fhàs ann am pleitean sia-tobair aig dùmhlachd de 0.3 × 106 ceallan/mL airson 24 uairean mus deach an làimhseachadh. Chaidh RNA a thoirt a-mach a’ cleachdadh protocol Quick-RNA™ Miniprep (ZR R1055, Zymo Research) le beagan atharrachaidhean: cuir 300 μl de bufair lysis RNA ri gach tobar mus tèid a thoirt air falbh agus lysis gach sampall mar cheum mu dheireadh le 30 μl de dh’uisge gun elution DNase/RNase. Chaidh sgrùdadh a dhèanamh air meud agus càileachd nan sampallan uile a’ cleachdadh NanoDrop ND-1000 UV-Vis Spectrophotometer. Fhuaireadh pròtain iomlan bho lysates cealla a’ cleachdadh 200 μl de bufair lysis RIPA, agus chaidh dùmhlachd pròtain a thomhas a’ cleachdadh deuchainn pròtain Bradford70.
Chaidh co-chur cDNA a dhèanamh le bhith a’ cleachdadh Pasgan Co-chur cDNA Tetro™ (BIO-65043, Meridian Bioscience) a rèir stiùiridhean an neach-dèanamh le beagan atharrachaidhean. Chaidh cDNA a cho-chur ann an ath-bheachdan 20-μl le bhith a’ cleachdadh 0.7 gu 1 μg de RNA iomlan. Chaidh prìomaran a thaghadh bho phàipearan a chaidh fhoillseachadh roimhe 42, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78 (Clàr S1) agus chaidh proban co-cheangailte a dhealbhadh le bhith a’ cleachdadh an inneal PrimerQuest bho Integrated DNA Technologies. Chaidh a h-uile gine a bha fo cheist a dhèanamh àbhaisteach don ghine niùclasach B2M. Chaidh abairt gine STOML2, NRF1, NFE2L2, TFAM, cMYC agus OPA1 a thomhas le RT-qPCR. Bha am measgachadh maighstir a’ toirt a-steach polymerase LUNA Taq (M3003L, New England Biolabs), 10 μM de phrìmearan air adhart is air ais, cDNA, agus uisge ìre PCR gus meud deireannach de 10 μL fhaighinn airson gach ath-bhualadh. Chaidh abairt ghinean roinneadh is sgoltadh (DRP1, MFN1/2) a thomhas a’ cleachdadh deuchainnean ioma-fhillte TaqMan. Chaidh Measgachadh Maighstir Luna Universal Probe qPCR (M3004S, New England Biolabs) a chleachdadh a rèir stiùiridhean an neach-dèanamh le beagan atharrachaidhean. Tha am measgachadh maighstir ioma-fhillte RT-qPCR a’ toirt a-steach polymerase 1X LUNA Taq, 10 μM de phrìmearan air adhart is air ais, probe 10 μM, cDNA, agus uisge ìre PCR, agus mar thoradh air sin bha meud deireannach de 20 μL ann airson gach ath-bhualadh. Chaidh RT-qPCR a dhèanamh a’ cleachdadh Rotor-Gene Q 6-plex (QIAGEN RG—àireamh sreathach: R0618110). Tha na suidheachaidhean rothaireachd air an sealltainn ann an Clàr S1. Chaidh na sampallan cDNA uile a mheudachadh ann an trì leth-bhreac agus chaidh lùb àbhaisteach a chruthachadh a’ cleachdadh sreath de chaolachaidhean deich-fhillte. Chaidh luachan a-muigh ann an sampallan trì-fhillte le claonadh àbhaisteach stairsneach cearcall (Ct) >0.5 a thoirt air falbh bhon anailis gus dèanamh cinnteach à ath-riochdachadh dàta30,72. Chaidh abairt gine coimeasach obrachadh a-mach a’ cleachdadh an dòigh 2-ΔΔCt79.
Chaidh sampallan pròtain (60 μg) a mheasgachadh le bufair luchdaidh Laemmli aig co-mheas 2:1 agus an ruith air gel pròtain gun dath 12% (Bio-Rad #1610184). Chaidh pròtainean a ghluasad gu membran PVDF (polyvinylidene fluoride) (#170-84156, Bio-Rad) a’ cleachdadh an t-siostam Trans-Blot Turbo (#170-4155, Bio-Rad). Chaidh am membran a bhacadh agus a ghoir leis na prìomh antibodies iomchaidh (OPA1, MFN1, MFN2, agus DRP1) (air an caolachadh 1:1000) airson 48 uairean, agus an uairsin a ghoir le antibodies àrd-sgoile (1:10,000) airson 1 uair. Chaidh na membranan an uairsin a dhealbhadh le Clarity Western ECL Substrate (#170-5061, Bio-Rad) agus a chlàradh le siostam Bio-Rad ChemiDoc MP. Chaidh ImageLab dreach 6.1 a chleachdadh airson mion-sgrùdadh Western blot. Tha an gel agus am blot tùsail air an sealltainn ann am Figear S1. Tha fiosrachadh mu na h-antasubstaint ri fhaighinn ann an Clàr S2.
Tha seataichean dàta air an taisbeanadh mar a’ chuibheasachd agus mearachd àbhaisteach a’ chuibheasaich (SEM) de co-dhiù trì sampallan neo-eisimeileach. Chaidh seataichean dàta a dhearbhadh airson àbhaisteachd a’ cleachdadh deuchainn Shapiro-Wilks (mura h-eilear ag ràdh a chaochladh) mus deach gabhail ri sgaoileadh Gaussian agus claonaidhean àbhaisteach co-ionnan agus a dhol air adhart leis na mion-sgrùdaidhean. A bharrachd air a bhith a’ dèanamh mion-sgrùdadh air an t-seata dàta a’ cleachdadh MEL LSD Fisher (p < 0.05), ANOVA aon-shligheach (mean làimhseachaidh an aghaidh smachd), agus deuchainn ioma-choimeas Dunnett gus cudromachd a dhearbhadh (p < 0.05). Tha luachan p cudromach air an sealltainn anns a’ ghraf mar *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001. Chaidh a h-uile mion-sgrùdadh staitistigeil agus graf a dhèanamh agus a chruthachadh a’ cleachdadh GraphPad Prism 9.4.0.
Tha macraidhean Fiji/ImageJ airson mion-sgrùdadh ìomhaighean TEM rim faighinn gu poblach air GitHub: https://github.com/caaja/TEMMitoMacro. Tha am macra Mitochondrial Event Locator (MEL) ri fhaighinn gu poblach air GitHub: https://github.com/rensutheart/MEL-Fiji-Plugin.
Meiliana A., Devi NM agus Vijaya A. Mitochondria: prìomh riaghladairean metabolism, homeostasis, cuideam, aosachadh agus epigenetics. Indonesian. Biomedical Science. J. 13, 221–241 (2021).
Ben-Shachar, D. Eas-ghnìomhachd mitochondrial ioma-thaobhach ann an sgitsophrenia, iom-fhillte I mar thargaid paiteòlach a dh’ fhaodadh a bhith ann. Sgitsophrenia. goireas. 187, 3–10 (2017).
Bose, A. agus Beal, MF Eas-ghnìomhachd mitochondrial ann an galar Pharkinson. J. Neurochemistry. 139, 216–231 (2016).
Sharma VK, Singh TG agus Mehta V. Mitochondria fo chuideam: targaidean ionnsaigh ann an galar Alzheimer. Mitochondria 59, 48–57 (2021).
Belenguer P., Duarte JMN, Shook PF agus Ferreira GK Mitochondria agus an eanchainn: bith-lùth-eòlas agus barrachd. Neurotoxins. goireas. 36, 219–238 (2019).
Rangaraju, V. et al. Mitochondria pleiotropic: buaidh mitochondria air leasachadh agus galair neuronal. J. Neuroscience. 39, 8200–8208 (2019).
Cardaño-Ramos, C. agus Morais, VA Biogenesis mitochondrial ann an neurons: ciamar agus càite. eadar-nàiseantachd. J. Mohr. an saidheans. 22, 13059 (2021).
Yu, R., Lendahl, U., Nister, M. agus Zhao, J. Riaghladh daineamaigs mitochondrial mamalan: cothroman agus dùbhlain. aghaidh. endocrine. (Lausanne) 11, 374 (2020).
Khacho, M. agus Slack, RS Daineamaigs mitochondrial ann an riaghladh neurogenesis: bhon eanchainn a tha a’ leasachadh gu eanchainn inbheach. leasachadh. daineamaigs. 247, 47–53 (2018).