An-dràsta *Seòladh làithreach: Köln 50931, a' Ghearmailt, Rannsachadh Cruinneachaidh Sàr-mhathais Köln air Freagairt Strus Ceallach ann an Galaran co-cheangailte ri Aois (CECAD).
Thathas den bheachd nach gabh a thionndadh air ais neurodegeneration ghalaran mitochondrial leis gu bheil plasticity metabolic neurons cuingealaichte, ach chan eil buaidh mì-ghnìomhachd mitochondrial air fèin-riaghladh cealla metabolism neuronal sa bhodhaig air a thuigsinn gu math. An seo, tha sinn a’ toirt a-steach proteome sònraichte do cheallan neurons Purkinje le easbhaidh OXPHOS adhartach air adhbhrachadh le daineamaigs fusion mitochondrial a chaidh a bhriseadh. Fhuair sinn a-mach gun do bhrosnaich mì-ghnìomhachd mitochondrial atharrachadh mòr ann an raon proteomics, a lean gu gnìomhachd sreathmhor phrògraman metabolach mionaideach mus do bhàsaich cealla. Gu h-obann, lorg sinn brosnachadh follaiseach pyruvate carboxylase (PCx) agus enzyman an-aois eile a bhios a’ cur ri eadar-mheadhanairean cearcall TCA. Mheudaich casg PCx cuideam oxidative agus neurodegeneration, a’ nochdadh gu bheil buaidh dìon aig atherosclerosis ann an neurons aig nach eil OXPHOS. Bidh ath-nuadhachadh fusion mitochondrial ann an neurons a tha air crìonadh gu crìch a’ tionndadh nan feartan metabolach sin gu tur, agus mar sin a’ cur casg air bàs cealla. Tha na co-dhùnaidhean againn a’ comharrachadh slighean nach robh aithnichte roimhe a bheir seasmhachd do mhì-ghnìomhachd mitochondrial agus a’ sealltainn gum faodar neurodegeneration a thionndadh air ais eadhon anns na h-ìrean deireannach den ghalar.
Tha prìomh dhreuchd mitochondria ann a bhith a’ cumail suas metabolism lùtha neuronal air a neartachadh leis na comharraidhean neurolach farsaing a tha co-cheangailte ri galairean mitochondrial daonna. Tha a’ mhòr-chuid de na galairean sin air adhbhrachadh le mùthaidhean gine a bhios a’ riaghladh abairt gine mitochondrial (1, 2) no sgrios gine co-cheangailte ri daineamaigs mitochondrial, a bheir buaidh neo-dhìreach air seasmhachd DNA mitochondrial (mtDNA) (3, 4). Tha obair ann am modalan bheathaichean air sealltainn, mar fhreagairt do mhì-ghnìomhachd mitochondrial ann an clòthan mun cuairt, gum faodar slighean metabolach glèidhteach (5-7) a ghnìomhachadh, a bheir seachad fiosrachadh cudromach airson tuigse dhomhainn air pathogenesis nan galairean iom-fhillte seo. An coimeas ri sin, tha ar tuigse air na h-atharrachaidhean metabolach ann an seòrsachan cealla sònraichte air adhbhrachadh le fàilligeadh coitcheann cinneasachadh adenosine triphosphate (ATP) mitochondrial eanchainn bunaiteach (8), a’ cur cuideam air an fheum air targaidean leigheasach a chomharrachadh a dh’ fhaodar a chleachdadh gus casg a chuir air galair no casg a chuir air neurodegeneration (9). Is e dìth fiosrachaidh an fhìrinn gu bheilear den bheachd gu farsaing gu bheil sùbailteachd metabolach glè chuingealaichte aig ceallan nearbh an taca ri seòrsachan cealla clòthan mun cuairt (10). Leis gu bheil na ceallan seo a’ cluich pàirt chudromach ann a bhith a’ co-òrdanachadh solar metabolites gu neurons gus tar-chur synaptic adhartachadh agus freagairt a thoirt do leòntan is tinneasan, tha an comas metabolism cealla atharrachadh gu na suidheachaidhean dùbhlanach ann an clò eanchainn cha mhòr air a chuingealachadh ri ceallan glial (11-14). A bharrachd air an sin, tha an neo-chunbhalachd ceallach nàdarrach ann an clò eanchainn a’ cur bacadh mòr air sgrùdadh atharrachaidhean metabolach a tha a’ tachairt ann am fo-bhuidhnean neuronal sònraichte. Mar thoradh air an sin, chan eil mòran fiosrachaidh againn mu na builean ceallach is metabolach ceart a tha aig mì-ghnìomhachd mitochondrial ann an neurons.
Gus tuigse fhaighinn air na builean metabolach a tha aig mì-ghnìomhachd mitochondrial, sgar sinn neurons Purkinje (PNs) ann an diofar ìrean de neurodegeneration air adhbhrachadh le sgrios fusion membran a-muigh mitochondrial (Mfn2). Ged a tha mùthaidhean Mfn2 ann an daoine co-cheangailte ri seòrsa de neuropathy motair mothachaidh oighreachail ris an canar Charcot-Marie-Tooth seòrsa 2A (15), tha sgrios cumhach Mfn2 ann an luchagan na dhòigh aithnichte airson mì-ghnìomhachd brosnachaidh oxidation phosphorylation (OXPHOS). Tha comharraidhean neurolach adhartach, leithid eas-òrdughan gluasaid (18, 19) no ataxia cerebellar (16), an cois nan diofar fho-sheòrsan neuronal (16-19) agus an phenotype neurodegenerative a thig às. Le bhith a’ cleachdadh measgachadh de proteomics cainneachdail gun leubail (LFQ), metabolomics, ìomhaighean, agus dòighean bhìorasach, tha sinn a’ sealltainn gu bheil neurodegeneration adhartach ag adhbhrachadh gu làidir pyruvate carboxylase (PCx) agus factaran eile a tha an sàs ann an arteriosclerosis de PNs in vivo Abairt enzyman. Gus dearbhadh cho buntainneach sa tha an lorg seo, lughdaich sinn gu sònraichte abairt PCx ann am PNan easbhaidheach ann am Mfn2, agus fhuair sinn a-mach gun do dh’fhàs an obair-lannsa seo nas miosa le cuideam oxidative agus gun do luathaich e neurodegeneration, agus mar sin a’ dearbhadh gu bheil azoospermia a’ toirt seachad atharrachadh metabolach bàs cealla. Faodaidh abairt làidir de MFN2 an PN crìonadh deireannach a shàbhaladh gu tur le easbhaidh OXPHOS mòr, caitheamh mòr de DNA mitochondrial, agus lìonra mitochondrial briste a rèir coltais, a tha a’ cur cuideam air gum faod an seòrsa neurodegeneration seo faighinn seachad air eadhon aig ìre adhartach a’ ghalair mus bàsaich cealla.
Gus na mitochondria ann am PNan cnagadh-a-mach Mfn2 fhaicinn, chleachd sinn seòrsa luchaige a leigeas le mitochondria a tha an urra ri Cre targaid a dhèanamh air abairt Cre pròtain fluorescent buidhe (YFP) (mtYFP) (20) agus rinn sinn sgrùdadh air morf-eòlas mitochondrial in vivo. Fhuair sinn a-mach gum biodh sgrios a’ ghine Mfn2 ann am PNan a’ leantainn gu roinneadh mean air mhean den lìonra mitochondrial (Figear S1A), agus chaidh an t-atharrachadh as tràithe a lorg aig aois 3 seachdainean. An coimeas ri sin, cha do thòisich crìonadh mòr sreath cealla PN, mar a chithear le call dìon-dhath Calbindin, gus an robh e 12 seachdainean a dh'aois (Figear 1, A agus B). Thug an neo-cho-fhreagarrachd ùine eadar na h-atharrachaidhean as tràithe ann am morf-eòlas mitochondrial agus toiseach faicsinneach bàs neuronal oirnn sgrùdadh a dhèanamh air na h-atharrachaidhean metabolach air an adhbhrachadh le mì-ghnìomhachd mitochondrial mus do bhàsaich cealla. Leasaich sinn ro-innleachd stèidhichte air seòrsachadh cealla gnìomhaichte le fluorescence (FACS) gus PN a tha a’ cur an cèill YFP (YFP+) a sgaradh (Figear 1C), agus ann an luchagan smachd (Mfn2 + / loxP :: mtYFP loxP- stop-loxP: : L7-cre), ris an canar CTRL an-seo às dèidh seo (Figear S1B). Leigidh an leasachadh air an ro-innleachd geatachaidh stèidhichte air dian coimeasach comharra YFP leinn corp YFP+ (YFPHigh) de PNan a ghlanadh bho neo-PNan (YFPneg) (Figear S1B) no mìrean axon/dendritic fluorescent a tha fo amharas (YFPlow; Figear S1D, clì), air an dearbhadh le miocroscop confocal (Figear S1D, deas). Gus dearbh-aithne an t-sluaigh sheòrsaichte a dhearbhadh, rinn sinn proteomics LFQ agus an uairsin mion-sgrùdadh prìomh phàirtean, agus fhuair sinn a-mach gu bheil dealachadh soilleir eadar ceallan YFPHigh agus YFPneg (Figear S1C). Sheall ceallan YFPhigh beairteachadh lom de chomharran PN aithnichte (ie Calb1, Pcp2, Grid2 agus Itpr3) (21, 22), ach gun bheairteachadh de phròtainean a tha cumanta ann an neurons no seòrsachan cealla eile (Figear 1D)). Sheall coimeas eadar sampallan ann an ceallan YFPhigh seòrsaichte a chaidh a chruinneachadh ann an deuchainnean neo-eisimeileach co-èifeachd co-dhàimh> 0.9, a’ sealltainn deagh ath-riochdachadh eadar ath-aithrisean bith-eòlasach (Figear S1E). Mar gheàrr-chunntas, dhearbh an dàta seo ar plana airson dealachadh geur agus sònraichte de PN a dh’ fhaodadh a bhith ann. Leis gu bheil an siostam draibhear L7-cre a chaidh a chleachdadh ag adhbhrachadh ath-chur moasaig anns a’ chiad seachdain às deidh breith (23), thòisich sinn a’ marbhadh luchagan bho CTRL agus a’ cruinneachadh neurons le cumhachan (Mfn2 loxP / loxP :: mtYFP loxP-stop-loxP :: L7-cre). Às deidh an ath-chur a chrìochnachadh, canar Mfn2cKO ris aig 4 seachdainean a dh'aois. Mar a’ phuing crìochnachaidh, thagh sinn 8 seachdainean a dh’aois nuair a bha an sreath PN slàn a dh’aindeoin an sgaradh mitochondrial follaiseach (Figear 1B agus Figear S1A). Gu h-iomlan, rinn sinn tomhas air 3013 pròtainean gu h-iomlan, agus bha mu 22% dhiubh sin stèidhichte air notaichean MitoCarta 2.0 stèidhichte air a’ phròteome mitochondrial mar mitochondria (Figear 1E) (Figear 1E) (24). Sheall an anailis eadar-dhealaichte air abairt gine a chaidh a dhèanamh aig seachdain 8 nach robh atharrachaidhean mòra ach aig 10.5% de na pròtainean uile (Figear 1F agus Figear S1F), agus bha 195 pròtain dhiubh sin air an lughdachadh agus 120 pròtain air an àrdachadh (Figear 1F). Is fhiach a thoirt fa-near gu bheil an “anailis slighe ùr-ghnàthach” den t-seata dàta seo a’ sealltainn gu bheil na ginean a tha air an cur an cèill gu eadar-dhealaichte a’ buntainn sa mhòr-chuid ri seata cuibhrichte de shlighean metabolach sònraichte (Figear 1G). Gu inntinneach, ged a tha an lùghdachadh ann an slighean co-cheangailte ri OXPHOS agus comharran calcium a’ dearbhadh gu bheil mì-ghnìomhachd mitochondrial air a bhrosnachadh ann am PNan easbhaidheach fusion, tha roinnean eile a tha sa mhòr-chuid a’ toirt a-steach metabolism amino-aigéid air an àrdachadh gu mòr, a tha a rèir an metabolism a tha a’ tachairt ann am PNan mitochondrial. Tha ath-uèirleadh cunbhalach.
(A) Dealbhan confocal riochdachail de earrannan cerebellar de luchagan CTRL agus Mfn2cKO a’ sealltainn call mean air mhean de PNn (calbindin, liath); chaidh niuclasan a cho-dhath le DAPI. (B) Meudachadh air (A) (mion-sgrùdadh aon-shligheach air atharrachaidh, ***P<0.001; n = 4 gu 6 cearcallan bho thrì luchagan). (C) Sruth-obrach deuchainneach. (D) Sgaoileadh mapa teas de chomharran sònraichte do Purkinje (gu h-àrd) agus seòrsachan cealla eile (meadhan). (E) Diagram Venn a’ sealltainn an àireamh de phròtainean mitochondrial a chaidh an comharrachadh anns a’ PN seòrsaichte. (F) Cuilbheart bholcàno de phròtainean air an cur an cèill gu eadar-dhealaichte ann an niùronan Mfn2cKO aig 8 seachdainean (luach gearraidh cudromachd de 1.3). (G) Tha mion-sgrùdadh slighe na cruthachalachd a’ sealltainn na còig slighean suas-riaghlaidh (dearg) agus sìos-riaghlaidh (gorm) as cudromaiche ann am PN Mfn2cKO air a sheòrsachadh mar 8 seachdainean. Tha an ìre abairteachd chuibheasach de gach pròtain a chaidh a lorg air a shealltainn. Mapa teas liath-sgèile: luach P atharraichte. ns, gun a bhith cudromach.
Sheall dàta proteomics gun do lùghdaich an abairt pròtain de cho-thàthaidhean I, III, agus IV mean air mhean. Bha fo-aonadan riatanach còdaichte le mtDNA anns na co-thàthaidhean I, III, agus IV uile, agus cha robh buaidh mhòr aig co-thàthadh II, nach robh ach còdaichte le niùclas (Figear 2A agus Figear S2A). . A rèir thoraidhean proteomics, sheall immunohistochemistry earrannan clò cerebellar gun do lùghdaich ìre fo-aonad MTCO1 (fo-aonad 1 cytochrome C oxidase mitochondrial) de cho-thàthadh IV ann am PN mean air mhean (Figear 2B). Chaidh an fo-aonad Mtatp8 còdaichte le mtDNA a lùghdachadh gu mòr (Figear S2A), agus dh’fhan ìre staid sheasmhach an fho-aonad synthase ATP còdaichte le niùclas gun atharrachadh, a tha a rèir an fho-chruinneachaidh ATP synthase seasmhach F1 a tha aithnichte nuair a tha abairt mtDNA seasmhach. Tha an cruthachadh cunbhalach. Eadar-theachd (7). Dhearbh measadh air ìre mtDNA anns na PNan Mfn2cKO seòrsachaichte le freagairt slabhraidh polymerase fìor-ùine (qPCR) an lùghdachadh mean air mhean ann an àireamh leth-bhreac mtDNA. An coimeas ris a’ bhuidheann smachd, aig 8 seachdainean a dh’aois, cha deach ach mu 20% den ìre mtDNA a chumail (Figear 2C). A rèir nan toraidhean sin, chaidh dathadh microscopaidh confocal de PNan Mfn2cKO a chleachdadh gus DNA a lorg, a’ sealltainn caitheamh ùine de niùclasaidean mitochondrial (Figear 2D). Fhuair sinn a-mach nach robh ach cuid de na tagraichean a bha an sàs ann an lobhadh pròtain mitochondrial agus freagairt cuideam air an riaghladh suas, nam measg Lonp1, Afg3l2 agus Clpx, agus factaran cruinneachaidh iom-fhillte OXPHOS. Cha deach atharrachaidhean mòra sam bith a lorg ann an ìrean nam pròtainean a tha an sàs ann an apoptosis (Figear S2B). San aon dòigh, fhuair sinn a-mach nach eil ach atharrachaidhean beaga anns na seanalan mitochondria agus reticulum endoplasmic a tha an sàs ann an còmhdhail calcium (Figear S2C). A bharrachd air an sin, cha d’ fhuair measadh air pròtainean co-cheangailte ri autophagy atharrachaidhean mòra sam bith, a tha a rèir an inntrigeadh faicsinneach de autophagosomes a chithear in vivo le immunohistochemistry agus microscopy electron (Figear S3). Ach, tha atharrachaidhean mitochondrial ultrastructural follaiseach an cois mì-ghnìomhachd adhartach OXPHOS ann am PNs. Chithear cruinneachaidhean mitochondrial anns na cuirp cealla agus craobhan dendritic de PNs Mfn2cKO aig aois 5 agus 8 seachdainean, agus tha structar a’ membran a-staigh air a dhol tro atharrachaidhean mòra (Figear S4, A agus B). A rèir nan atharrachaidhean ultrastructural seo agus lùghdachadh mòr ann am mtDNA, sheall mion-sgrùdadh air slisneagan cerebellar cerebral géar le tetramethylrhodamine methyl ester (TMRM) gun deach comas membran mitochondrial ann am PNs Mfn2cKO a lùghdachadh gu mòr (Figear S4C).
(A) Mion-sgrùdadh cùrsa-ama air ìre abairteachaidh co-thàthadh OXPHOS. Beachdaich a-mhàin air pròtainean le P<0.05 aig 8 seachdainean (ANOVA dà-shligheach). Loidhne dhotagach: Gun atharrachadh an taca ri CTRL. (B) Clì: Eisimpleir de earrann cerebellar air a chomharrachadh le antibody an-aghaidh MTCO1 (bàr-sgèile, 20 μm). Tha an raon air a bheil cuirp cealla Purkinje còmhdaichte le buidhe. Deas: Meudachadh ìrean MTCO1 (mion-sgrùdadh aon-shligheach air atharrachaidh; n = 7 gu 20 cealla air an sgrùdadh bho thrì luchagan). (C) Mion-sgrùdadh qPCR air àireamh leth-bhreac mtDNA anns a’ PN seòrsachaidh (mion-sgrùdadh aon-shligheach air atharrachaidh; n = 3 gu 7 luchagan). (D) Clì: Eisimpleir de shliseag cerebellar air a chomharrachadh le antibody an-aghaidh DNA (bàr-sgèile, 20 μm). Tha an raon air a bheil cuirp cealla Purkinje còmhdaichte le buidhe. Deas: Meudachadh leòintean mtDNA (mion-sgrùdadh aon-shligheach air atharrachaidh; n = 5 gu 9 ceallan bho thrì luchagan). (E) Eisimpleir de earrann cerebellar géar a’ sealltainn ceallan mitoYFP + Purkinje (saighead) ann an clàradh clamp paiste cealla slàn. (F) Meudachadh lùb IV. (G) Clàraidhean riochdachail de stealladh sruth dì-phòlarachaidh ann an ceallan Purkinje CTRL agus Mfn2cKO. Lorg àrd: A’ chiad chuisle a bhrosnaich AP. Lorg ìosal: Tricead AP as àirde. (H) Meudachadh cuir-a-steach spontanach postsynaptic (sPSPs). Tha an lorg clàraidh riochdachail agus a cho-mheas zoom air an sealltainn ann an (I). Mion-sgrùdadh aon-shligheach air atharrachaidh air a sgrùdadh n = 5 gu 20 cealla bho thrì luchagan. Tha dàta air a chur an cèill mar chuibheasachd ± SEM; *P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001. (J) Lorgan riochdachail de AP spontanach air an clàradh a’ cleachdadh modh clamp paiste tollta. Lorg àrd: Tricead AP as àirde. Lorg ìosal: zoom aon AP. (K) Meudaich tricead cuibheasach agus as àirde AP a rèir (J). Deuchainn Mann-Whitney; chaidh n = 5 ceallan a sgrùdadh bho cheithir luchagan. Tha dàta air a chur an cèill mar chuibheasachd ± SEM; chan eil e cudromach.
Chaidh milleadh follaiseach OXPHOS a lorg anns an Mfn2cKO PN 8 seachdainean a dh'aois, a’ nochdadh gu bheil gnìomh fiseòlasach neurons gu math neo-àbhaisteach. Mar sin, rinn sinn mion-sgrùdadh air feartan dealain fulangach neurons easbhaidheach OXPHOS aig 4 gu 5 seachdainean agus 7 gu 8 seachdainean le bhith a’ dèanamh chlàraidhean clamp paiste cealla slàn ann an sliseagan cerebellar géar (Figear 2E). Gu h-obann, bha comas cuibheasach membran fois agus strì an cuir a-steach neurons Mfn2cKO coltach ris a’ smachd, ged a bha eadar-dhealachaidhean beaga eadar ceallan (Clàr 1). San aon dòigh, aig 4 gu 5 seachdainean a dh'aois, cha deach atharrachaidhean mòra sam bith a lorg anns an dàimh sruth-bholtaids (lùb IV) (Figear 2F). Ach, cha do mhair neurons Mfn2cKO 7 gu 8 seachdainean a dh'aois an rèim IV (ceum hyperpolarization), a’ nochdadh gu bheil cugallachd shoilleir ann do chomas hyperpolarization aig an ìre fhadalach seo. An coimeas ri sin, ann an niùronan Mfn2cKO, tha na sruthan dì-phòlarachaidh a dh’ adhbharaicheas sgaoilidhean comas gnìomh ath-aithriseach (AP) air an gabhail gu math, a’ nochdadh nach eil na pàtrain sgaoilidh iomlan aca gu math eadar-dhealaichte bho na niùronan smachd 8 seachdainean a dh’aois (Clàr 1 agus Figear 2G). San aon dòigh, bha tricead agus leud sruthan postsynaptic spontaneous (sPSCs) co-chosmhail ri sruthan a’ bhuidhinn smachd, agus mheudaich tricead thachartasan bho 4 seachdainean gu 5 seachdainean gu 7 seachdainean gu 8 seachdainean le àrdachadh coltach ris (Figear 2, H agus I). An ùine aibidh synaptic ann am PNs (25). Fhuaireadh toraidhean coltach ris às deidh badan PNs tollta. Tha an rèiteachadh seo a’ cur casg air dìoladh a dh’ fhaodadh a bhith ann airson lochdan ATP ceallach, mar a dh’ fhaodadh tachairt ann an clàradh clamp badan cealla slàn. Gu sònraichte, cha deach buaidh a thoirt air comas membran fois agus tricead losgaidh spontaneous niùronan Mfn2cKO (Figear 2, J agus K). Mar gheàrr-chunntas, tha na toraidhean seo a’ nochdadh gum faod PNan le mì-ghnìomhachd follaiseach OXPHOS dèiligeadh gu math ri pàtrain sgaoilidh àrd-tricead, a’ nochdadh gu bheil dòigh-dìolaidh ann a leigeas leotha freagairtean electro-fhiseòlasach faisg air àbhaisteach a chumail suas.
Tha dàta air a chur an cèill mar chuibheasachd ± SEM (mion-sgrùdadh aon-shligheach air atharrachaidh, deuchainn coimeas ioma-fhillte Holm-Sidak; *P<0.05). Tha an àireamh aonaid air a chomharrachadh le camagan.
Shuidhich sinn a-mach sgrùdadh a dhèanamh air an robh slighean ann an roinn sam bith anns an t-seata dàta proteomics (Figear 1G) a dh’ fhaodadh easbhaidh OXPHOS dona a chasg, agus mar sin a’ mìneachadh carson as urrainn do PN air a bheil buaidh electrophysiology faisg air àbhaisteach a chumail suas (Figear 2, E gu K). . Sheall mion-sgrùdadh proteomics gu robh na h-einsìmean a bha an sàs ann an catabolism amino-aigéid slabhraidh mheurach (BCAA) air an àrdachadh gu mòr (Figear 3A agus Figear S5A), agus faodaidh an toradh deireannach acetyl-CoA (CoA) no succinyl CoA cur ris na tricarboxylates ann an cearcall searbhag arteriosclerosis (TCA). Fhuair sinn a-mach gun do dh’ èirich susbaint BCAA transaminase 1 (BCAT1) agus BCAT2 le chèile. Bidh iad a’ catalachadh a’ chiad cheum de catabolism BCAA le bhith a’ gineadh glutamate bho α-ketoglutarate (26). Tha na fo-aonadan uile a tha a’ dèanamh suas an co-thàthadh keto searbhag dehydrogenase slabhraidh mheurach (BCKD) air an àrdachadh (bidh an co-thàthadh a’ catalachadh dì-charboxylation às dèidh sin agus neo-atharrachail den chnàimh-charboin BCAA a thig às a sin) (Figear 3A agus Figear S5A). Ach, cha deach atharrachaidhean follaiseach sam bith a lorg anns a’ PN seòrsachaichte, a dh’ fhaodadh a bhith mar thoradh air barrachd gabhail ceallach de na amino-aigéid riatanach seo no cleachdadh stòran eile (glùcois no searbhag lactach) gus cur ris a’ chearcall TCA (Figear S5B). Sheall PNan aig nach robh OXPHOS barrachd gnìomhachd lobhadh glutamine agus transamination aig 8 seachdainean a dh'aois, a chithear le àrdachadh nan enzyman mitochondrial glutaminase (GLS) agus glutamine pyruvate transaminase 2 (GPT2) (Figear 3, A agus C). Is fhiach a thoirt fa-near gu bheil àrdachadh GLS cuingealaichte ris an isoform spliced ​​glutaminase C (GLS-GAC) (tha an t-atharrachadh ann am Mfn2cKO/CTRL timcheall air 4.5 uiread, P = 0.05), agus faodaidh an àrdachadh sònraichte aige ann an clò aillse bith-lùth mitochondrial a chumail suas. (27).
(A) Tha am mapa teas a’ sealltainn an atharrachaidh fillte ann an ìre pròtain airson an t-slighe shònraichte aig 8 seachdainean. (B) Eisimpleir de shliseag cerebellar air a chomharrachadh le antibody anti-PCx (bàr-sgèile, 20 μm). Tha an t-saighead bhuidhe a’ comharrachadh corp cealla Purkinje. (C) Mion-sgrùdadh ùine air abairt pròtain air a chomharrachadh mar thagraiche cudromach airson atherosclerosis (deuchainn-t iomadach, *FDR <5%; n = 3-5 luchagan). (D) Gu h-àrd: Diagram sgemataig a’ sealltainn nan diofar dhòighean air a dhol a-steach don charbon le bileag a tha anns an tracer [1-13C]pyruvate (ie, tro PDH no slighe thar-arterial). Gu h-ìosal: Tha clàr na fìdhle a’ sealltainn ceudad de charbon le bileag singilte (M1) air a thionndadh gu searbhag aspartic, searbhag citrach agus searbhag malic às deidh dha sliseagan cerebellar géar a chomharrachadh le [1-13C]pyruvate (deuchainn-t càraideach; ** P <0.01). (E) Mion-sgrùdadh eachdraidh ùine coileanta den t-slighe a chaidh a chomharrachadh. Beachdaich air pròtainean le P<0.05 aig 8 seachdainean a-mhàin. Loidhne briste: gun luach atharrachaidh (mion-sgrùdadh dà-shligheach air atharrachaidh; * P <0.05; *** P <0.001). Tha dàta air a chur an cèill mar chuibheasachd ± SEM.
Anns an anailis againne, tha catabolism BCAA air a thighinn gu bhith mar aon de na prìomh shlighean suas-riaghlaidh. Tha an fhìrinn seo a’ moladh gu làidir gum faodadh meud an fhionnarachadh a tha a’ dol a-steach don chearcall TCA a bhith air atharrachadh ann am PN aig nach eil OXPHOS. Dh’ fhaodadh seo a bhith a’ riochdachadh prìomh sheòrsa ath-uèirleadh metabolach neuronal, a dh’ fhaodadh buaidh dhìreach a thoirt air fiseòlas neuronal agus mairsinneachd rè cumail suas mì-ghnìomhachd OXPHOS cruaidh. A rèir a’ bharail seo, fhuair sinn a-mach gu bheil am prìomh einnsein an-atherosclerotic PCx air a riaghladh suas (bidh Mfn2cKO / CTRL ag atharrachadh timcheall air 1.5 uair; Figear 3A), a bhios a’ catalachadh tionndadh pyruvate gu oxaloacetate (28), a thathas a’ creidsinn a tha ann an clò eanchainn. Tha an abairt ann an cuingealaichte ri astrocytes (29, 30). A rèir nan toraidhean proteomics, sheall microscopy confocal gu robh abairt PCx air a mheudachadh gu sònraichte agus gu mòr ann am PNan aig nach eil OXPHOS, agus bha ath-ghnìomhachd PCx air a chuingealachadh sa mhòr-chuid ri ceallan glial Bergmann faisg air làimh den smachd (Figear 3B). Gus deuchainn gnìomhach a dhèanamh air an àrdachadh a chaidh fhaicinn ann am PCx, làimhsich sinn sliseagan cerebellar géar le tracer pyruvate [1-13C]. Nuair a chaidh pyruvate a oxidachadh le pyruvate dehydrogenase (PDH), dh’ fhalbh an leubail isotope aige, ach tha e air a ghabhail a-steach do eadar-mheadhanairean cearcall TCA nuair a thèid pyruvate a mheatabolachadh le ath-bheachdan vascular (Figear 3D). Mar thaic don dàta proteomics againn, chunnaic sinn àireamh mhòr de chomharran bhon tracer seo ann an searbhag aspartic sliseagan Mfn2cKO, agus bha gluasad meadhanach aig searbhag citreach agus searbhag malic cuideachd, ged nach robh e cudromach (Figear 3D).
Ann an neurons dopamine luchagan MitoPark le mì-ghnìomhachd mitochondrial air adhbhrachadh le neurons dopamine a’ sgrios gu sònraichte an gine factar tar-sgrìobhaidh mitochondrial A (Tfam) (Figear S6B), bha abairt PCx cuideachd air a mheudachadh gu mòr (31), a’ nochdadh gu bheil arteriosclerosis searbhag acetone. Tha tachartas a’ ghalair air a riaghladh rè mì-ghnìomhachd OXPHOS neuronal sa bhodhaig. Is fhiach a thoirt fa-near gun deach a lorg gu bheil enzyman sònraichte (32-34) a dh’ fhaodadh a bhith air an cur an cèill ann an neurons a dh’ fhaodadh a bhith co-cheangailte ri arteriosclerosis air an àrdachadh gu mòr ann am PNan aig a bheil dìth OXPHOS, leithid propionyl-CoA carboxylase (PCC-A), bidh Malonyl-CoA ag atharrachadh propionyl-CoA gu succinyl-CoA agus enzyme mitochondrial malic 3 (ME3), aig a bheil am prìomh dhleastanas pyruvate fhaighinn air ais bho malate (Figear 3, A agus C) (33, 35). A bharrachd air sin, fhuair sinn àrdachadh mòr anns an einnsein Pdk3, a bhios a’ fosfaraileadh agus mar sin a’ cur às do PDH (36), agus cha deach atharrachaidhean sam bith a lorg anns an einnsein Pdp1 a bhios a’ cur PDH an gnìomh no anns an iom-fhillte einnsein PDH fhèin (Figear 3A). Gu cunbhalach, ann am PNan Mern2cKO, chaidh fosfaraileadh fo-aonad α1 α (PDHE1α) fo-aonad a’ phàirt pyruvate dehydrogenase E1 den iom-fhillte PDH ann an Ser293 (a tha aithnichte airson casg a chuir air gnìomhachd einnsein PDH) a mheudachadh (Figear S6C) (Figear S6C). Chan eil ruigsinneachd shoithichean fala aig Pyruvate.
Mu dheireadh, fhuair sinn a-mach gu bheil slighe-shàr biosynthesis serine agus glycine, cearcall folate mitochondrial (1C) co-cheangailte agus biosynthesis proline (Figear 1G agus Figear S5C) uile air an àrdachadh gu mòr, a rèir aithisgean, rè a’ phròiseis gnìomhachaidh. Tha na figheagan mun cuairt air an gnìomhachadh le mì-ghnìomhachd mitochondrial (5-7). Sheall mion-sgrùdadh confocal a’ toirt taic don dàta proteomics seo, ann am PN le OXPHOS a dhìth, gun deach sliseagan cerebellar de luchagan 8 seachdainean a dh'aois a chuir fo serine hydroxymethyltransferase 2 (SHMT2), enzyme cudromach de chearcall folate mitochondrial. Freagairt dìonachd chudromach (Figear S5D). Ann an 13 sliseagan cerebellar géar air an goir le CU-glucose, dhearbh deuchainnean lorg metabolach tuilleadh àrdachadh biosynthesis serine agus proline, a’ nochdadh gun do mheudaich sruth isoforms gualain a-steach do serine agus proline (Figear S5E). Leis gu bheil na h-ath-bheachdan a bhios GLS agus GPT2 a’ brosnachadh an urra ri co-chur glutamate bho glutamine agus an transamination eadar glutamate agus α-ketoglutarate, tha an àrdachadh aca a’ nochdadh gu bheil iarrtas nas motha aig neurons aig a bheil gainnead OXPHOS airson glutamate. Is dòcha gu bheil seo ag amas air cumail suas barrachd biosynthesis de proline (Figear S5C). An coimeas ris na h-atharrachaidhean sin, sheall mion-sgrùdadh proteomic air astrocytes cerebellar bho luchagan Mfn2cKO sònraichte do PN nach do dh’ atharraich na slighean sin (a’ gabhail a-steach a h-uile antiperoxidases) gu mòr ann an abairt, agus mar sin a’ sealltainn gu bheil an ath-stiùireadh metabolach seo roghnach gu PN air a lughdachadh (Figear S6, D gu G).
Mar gheàrr-chunntas, nochd na mion-sgrùdaidhean seo pàtrain gu math eadar-dhealaichte de ghnìomhachd thar ùine slighean metabolach sònraichte ann am PNan. Ged a dh’ fhaodadh gnìomhachd mitochondrial neuronal neo-àbhaisteach leantainn gu atherosclerosis tràth agus ath-mhodaileadh 1C (Figear 3E agus Figear S5C), agus eadhon atharrachaidhean ro-innseach ann an abairt cho-thàthaidhean I agus IV, chan eil na h-atharrachaidhean ann an synthesis serine de novo follaiseach ach anns na h-ìrean nas fhaide air adhart. Neo-ghnìomhachd OXPHOS (Figear 3E agus Figear S5C). Tha na co-dhùnaidhean seo a’ mìneachadh pròiseas sreathmhor anns a bheil am mitochondrial (cearcall 1C) agus cytoplasm (bith-cho-chur serine) air adhbhrachadh le cuideam a’ freagairt gu sineirgisteach leis an àrdachadh ann an atherosclerosis anns a’ chearcall TCA gus metabolism neuronal ath-chumadh.
Faodaidh PNan easbhaidheach OXPHOS aig a bheil gnìomhachd brosnachaidh àrd-tricead a chumail suas agus ath-cheangal metabolach cudromach a dhèanamh gus dìoladh airson mì-ghnìomhachd mitochondrial. Tha an lorg seo a’ togail cothrom inntinneach gum faodadh na ceallan sin, eadhon aig an àm seo, eadar-theachd leigheasach fhaighinn gus neurodegeneration a chuir air ais no a chasg. Anmoch. Rinn sinn fuasgladh air a’ chothrom seo tro dhà eadar-theachd neo-eisimeileach. Anns a’ chiad dhòigh, dhealbhaich sinn vectar bhìoras co-cheangailte ri adeno (AAV) a tha an urra ri Cre gus an gabh MFN2 a chuir an cèill gu roghnach ann am PNan easbhaidheach OXPHOS in vivo (Figear S7A). Chaidh an AAV a’ còdachadh MFN2 agus an gine aithriseach fluorescent mCherry (Mfn2-AAV) a dhearbhadh ann an cultaran neuron bun-sgoile in vitro, a thug air MFN2 a bhith air a chuir an cèill ann an dòigh a tha an urra ri Cre agus a shàbhail morf-eòlas mitochondrial, agus mar sin a’ cur casg air neuromutation ann an neurons Mfn2cKO (Figear S7, B, D agus E). An ath rud, rinn sinn deuchainnean in vivo gus Mfn2-AAV 8 seachdainean a dh'aois a lìbhrigeadh gu stereotactach gu cortex cerebellar luchagan Mfn2cKO agus smachd, agus rinn sinn mion-sgrùdadh air luchagan 12 seachdainean a dh'aois (Figear 4A). Bhàsaich na luchagan Mfn2cKO a fhuair làimhseachadh (Figear 1, A agus B) (16). Mar thoradh air tar-chur bhìorasach in vivo, chaidh PN a chur an cèill gu roghnach ann an cuid de chearcaill cerebellar (Figear S7, G agus H). Cha robh buaidh mhòr aig stealladh an AAV smachd a bha a’ cur an cèill mCherry a-mhàin (Ctrl-AAV) air ìre neurodegeneration ann am beathaichean Mfn2cKO. An coimeas ri sin, sheall mion-sgrùdadh Mfn2cKOs a chaidh a thar-chur le Mfn2-AAV buaidh dhìona mhòr den t-sreath cealla PN (Figear 4, B agus C). Gu sònraichte, tha e coltach gu bheil dùmhlachd nan neuron cha mhòr do-dhealaichte bho na beathaichean smachd (Figear 4, B agus C, agus Figear S7, H agus I). Tha abairteachadh MFN1 ach chan e MFN2 a cheart cho èifeachdach ann a bhith a’ sàbhaladh bàs neuronal (Figear 4C agus Figear S7, C agus F), a tha a’ nochdadh gum faod abairteachadh MFN1 ectopic dìth MFN2 a neartachadh gu h-èifeachdach. Sheall tuilleadh mion-sgrùdaidh aig ìre PN singilte gun do shàbhail Mfn2-AAV structar ultra-sgòrna mitochondria gu ìre mhòr, gun do rinn e ìrean mtDNA àbhaisteach, agus gun do thionndaidh e an abairt àrd den chomharra an-aghaidh angiogenesis PCx ​​(Figear 4, C gu E). Sheall sgrùdadh lèirsinneach air na luchagan Mfn2cKO a chaidh a shàbhaladh ann an staid fois gun deach an suidheachadh agus na comharraidhean motair aca (gluasad S1 gu S3) a leasachadh. Mar cho-dhùnadh, tha na deuchainnean seo a’ sealltainn gu bheil ath-thoirt a-steach MFN2 a-steach do PNan aig a bheil gainnead mòr ann an OXPHOS gu leòr gus caitheamh mtDNA a thionndadh air ais agus atherosclerosis adhbhrachadh, agus mar sin a’ cur casg air crìonadh axon agus bàs neuronal in vivo.
(A) Sgeama a’ sealltainn a’ chlàr-ama deuchainneach airson stealladh AAV a’ còdachadh MFN2 nuair a thèid an t-slighe metabolach a tha air a chomharrachadh a ghnìomhachadh. (B) Ìomhaighean confocal riochdachail de shliseagan cerebellar 12 seachdain a dh'aois air an tar-chur aig 8 seachdainean ann an luchagan Mfn2cKO agus air an comharrachadh le antibody an-aghaidh Calbindin. Deas: Sgèileadh snàithleanan axon. Tha sgèile zoom an axon 450 agus 75 μm. (C) Clì: Meudachadh dùmhlachd cealla Purkinje ann an lùb tar-chuir AAV (AAV+) (mion-sgrùdadh aon-shligheach air atharrachaidh; n = 3 luchagan). Deas: mion-sgrùdadh fòcas mtDNA ann am PN tar-chuir aig seachdain 12 (deuchainn-t gun chàradh; n = 6 ceallan bho thrì luchagan). * P <0.05; ** P <0.01. (D) Micrografan dealanach tar-chuir riochdachail de PNan de earrannan cerebellar Mfn2cKO air an tar-chur leis na vectaran bhìorasach a tha air an comharrachadh. Tha am masg pinc a’ sealltainn na sgìre air a bheil dendrites, agus tha an ceàrnag buidhe le dotagan a’ sealltainn an zoom a tha air a thoirt seachad air an taobh cheart; tha n a’ riochdachadh an niùclas. Bàr-sgèile, 1μm. Tha (E) a’ sealltainn eisimpleir de dhath PCx ann am PN air a thar-chur aig 12 seachdain. Bàr-sgèile, 20μm. OE, cus-chur an cèill; FC, atharrachadh fillte.
Mu dheireadh, rinn sinn sgrùdadh air cho cudromach sa tha mairsinneachd cheallan air adhbhrachadh le peroxidase ann am PNan a tha air mì-ghnìomhachd OXPHOS fhulang. Chruthaich sinn mCherry a’ còdachadh AAV-shRNA (RNA goirid biorach) a bha ag amas gu sònraichte air mRNA PCx luchaige (AAV-shPCx), agus chuir sinn a-steach am bhìoras no a smachd sgrìobte (AAV-scr) a-steach do cherebellum luchagan Mfn2cKO. Chaidh an in-stealladh a dhèanamh anns a’ cheathramh seachdain de dh’aois (Figear 5A) gus bualadh sìos PCx èifeachdach a choileanadh rè na h-ùine nuair a mheudaich abairt PCx (Figear 3C) agus bha an sreath cealla PN fhathast slàn (Figear 1A). Is fhiach a thoirt fa-near gu bheil bualadh sìos PCx (Figear S8A) a’ leantainn gu luathachadh mòr ann am bàs PN, a tha cuingealaichte ris an fhàinne gabhaltach (Figear 5, B agus C). Gus tuigse fhaighinn air mar a tha buaidhean metabolach air an adhbhrachadh le àrdachadh PCx, rinn sinn sgrùdadh air inbhe redox PNan às deidh cnagadh sìos PCx agus chaidh Grx1-roGFP2, biosensor optigeach le meadhan AAV, a chuir an cèill aig an aon àm (Figear S8, B gu D) gus measadh a dhèanamh air glutathione. An t-atharrachadh coimeasach ann an comas redox peptide (38). An uairsin, rinn sinn microscopaidh ìomhaighean fad-beatha fluorescence dà-photon (FLIM) ann an sliseagan eanchainn géar de Mfn2cKO 7 seachdainean a dh'aois no de cho-aoisean sgudal smachd gus atharrachaidhean a dh’ fhaodadh a bhith ann an inbhe redox cytoplasmic a lorg às deidh dhuinn suidheachaidhean FLIM a dhearbhadh (Figear S8, E gu G). Sheall an anailis àrdachadh mòr ann an staid oxidation aon PN Mfn2cKO aig nach eil abairt PCx, a tha eadar-dhealaichte bho neurons smachd no PNan Mfn2cKO a’ cur an cèill dìreach shRNA sgrìobte (Figear 5, D agus E). Nuair a chaidh abairteachadh PCx a lùghdachadh, mheudaich ceudad PNan Mfn2cKO a bha a’ sealltainn staid àrd-ocsaidichte barrachd air trì uiread (Figear 5E), a’ nochdadh gun do chùm suas riaghladh PCx comas redox niùronan crìonaichte.
(A) Sgeama a’ sealltainn clàr-ama deuchainneach airson stealladh AAV a’ còdachadh shPCx nuair a thèid an t-slighe metabolach a tha air a chomharrachadh a ghnìomhachadh. (B) Dealbhan confocal riochdachail de earrannan cerebellar 8 seachdainean a dh'aois ann an luchagan Mfn2cKO air an tar-chur agus air an comharrachadh le antibody anti-calcineurin aig 4 seachdainean. Bàr sgèile, 450μm. (C) Meudachadh dùmhlachd cealla Purkinje ann an lùban AAV-tar-chuir (mion-sgrùdadh aon-shligheach air atharrachaidh; n = 3 gu 4 luchagan). Tha dàta air a chur an cèill mar chuibheasachd ± SEM; ***P<0.001. (D) Tha dealbh riochdachail FLIM a’ sealltainn fad-beatha cuibheasach PN 7 seachdainean a dh'aois a’ cur an cèill sensor redox glutathione Grx1-roGFP2 fo na cumhaichean deuchainneach ainmichte. Co-mheas LUT (clàr-sgrùdaidh): eadar-ama ùine mairsinn (ann am picoseconds). Bàr sgèile, 25μm. (E) Tha an histogram a’ sealltainn sgaoileadh luachan fad-beatha Grx1-roGFP2 bho (D) (n=158 gu 368 cealla ann an dà luchag fo gach suidheachadh). Tha a’ chairt-chearcaill os cionn gach histogram a’ sealltainn an àireamh de cheallan le luachan fad-beatha mòran nas fhaide (dearg, ocsaideichte) no nas giorra (gorm, lùghdaichte), a tha nas àirde na 1 SD den luach fad-beatha cuibheasach ann an CTRL-AAV-scr. (F) Tha am modail a thathar a’ moladh a’ sealltainn buaidh dìona àrdachadh PCx neuronal.
Gu h-iomlan, tha an dàta a bheir sinn seachad an seo a’ sealltainn gum faod ath-chur an cèill MFN2 PN adhartach le gainnead OXPHOS mòr, crìonadh mtDNA mòr, agus morf-eòlas coltach ri ista gu math neo-àbhaisteach a shàbhaladh gu tur, agus mar sin a’ toirt seachad adhartas leantainneach eadhon ann an galairean adhartach. Tha neurodegeneration a’ toirt seachad fianais ath-thionndaidheach den ìre mus bàsaich cealla. Tha an ìre seo de shùbailteachd metabolach air a neartachadh tuilleadh le comas neurons atherosclerosis adhbhrachadh (ath-uèirleadh cearcall TCA), a chuireas bacadh air cur an cèill PCx ann am PNan aig a bheil dìth OXPHOS agus a neartaicheas bàs cealla, agus mar sin a’ cluich pàirt dìon (Figear 5F).
Anns an sgrùdadh seo, thug sinn fianais seachad gur e freagairt PNan do mhì-ghnìomhachd OXPHOS a bhith a’ tighinn còmhla mean air mhean gu atherosclerosis cearcall TCA tron ​​t-slighe gnìomhachaidh eadar-dhealaichte air a ghnìomhachadh le prògraman metabolach. Dhearbh sinn an anailis proteomic le mòran dhòighean co-phàirteach agus nochd sinn nuair a bhios mì-ghnìomhachd mitochondrial cruaidh a’ cur dùbhlan orra, gu bheil cruth neo-aithnichte de elasticity metabolach aig neurons nach robh aithnichte roimhe. Chun ar n-iongnadh, chan eil am pròiseas ath-uèirleachaidh gu lèir gu riatanach a’ comharrachadh an staid metabolach crìochnachaidh a tha an cois neurodegeneration mean air mhean agus gu neo-atharrachail, ach tha an dàta againn a’ moladh gum faodadh e a bhith na neuron cumail suas eadhon anns an ìre ron bhàs cealla Meacanism dìolaidh gnìomh. Tha an lorg seo a’ nochdadh gu bheil ìre mhòr de plasticity metabolach aig neurons anns a’ bhodhaig. Tha an fhìrinn seo a’ dearbhadh gum faod ath-thoirt a-steach MFN2 nas fhaide air adhart abairt prìomh chomharran metabolach a thionndadh air ais agus casg a chuir air crìonadh PN. Air an làimh eile, bidh e a’ cur bacadh air atherosclerosis agus a’ luathachadh nearbhan. tar-ghnèitheach.
Is e aon de na co-dhùnaidhean as inntinniche san rannsachadh againn gum faod PNan aig a bheil dìth OXPHOS metabolism cearcall TCA atharrachadh le bhith ag àrdachadh einnseanan a bhios gu sònraichte a’ brosnachadh arteriosclerosis. Tha ath-rèiteachadh metabolach na fheart cumanta de cheallan aillse, agus tha cuid dhiubh an urra ri glutamine gus eadar-mheadhanairean cearcall TCA a neartachadh gus co-ionannachdan lughdachadh a thoirt gu buil, a bhios a’ stiùireadh an t-sreath analach agus a’ cumail suas cinneasachadh ro-ruithearan bith-cho-chur lipid agus nucleotide (39, 40). Sheall sgrùdadh o chionn ghoirid, ann an clò iomaill a tha a’ fulang mì-ghnìomhachd OXPHOS, gu bheil ath-cheangal metabolism glutamine / glutamate cuideachd na fheart follaiseach (5, 41), far a bheil stiùireadh inntrigeadh glutamine a-steach do chearcall TCA an urra ri Air sgàth cho dona ‘s a tha dochann OXPHOS (41). Ach, chan eil fianais shoilleir ann mu cho coltach ‘s a tha plasticity metabolach neuronal anns a’ bhodhaig agus a dh’ fhaodadh a bhith cudromach ann an co-theacsa a’ ghalair. Ann an sgrùdadh in vitro o chionn ghoirid, chaidh sealltainn gu robh neurons cortical bun-sgoile a’ gluasad amarlan glutamate airson neurotransmission, agus mar sin a’ brosnachadh metabolism oxidative agus atherosclerosis fo chumhachan cuideam metabolach (42). Is fhiach a thoirt fa-near, fo bhacadh cungaidh-leigheis einnsein cearcall TCA succinate dehydrogenase, gu bheilear a’ creidsinn gu bheil pyruvate carboxylation a’ cumail suas co-chur oxaloacetate ann an neurons granule cerebellar cultaraichte (34). Ach, tha cudromachd fiseòlasach fhathast aig a’ bhuntanas fiseòlasach a th’ aig na dòighean-obrach sin ri clò eanchainn (far a bheilear a’ creidsinn gu bheil atherosclerosis air a chuingealachadh sa mhòr-chuid ri astrocytes) (43). Anns a’ chùis seo, tha an dàta againn a’ sealltainn gum faodar PNan a tha air am milleadh le OXPHOS sa bhodhaig atharrachadh gu lobhadh BCAA agus carboxylation pyruvate, agus is iad sin an dà phrìomh thùs airson cur-ris eadar-mheadhanairean amar TCA. Ged a chaidh moladh a dhèanamh air tabhartas catabolism BCAA do metabolism lùtha neuronal, a bharrachd air dreuchd glutamate agus GABA airson neurotransmission (44), chan eil fianais ann fhathast airson na dòighean-obrach sin in vivo. Mar sin, tha e furasta a chreidsinn gum faod PNan mì-ghnìomhach dìoladh a dhèanamh gu fèin-ghluasadach airson caitheamh eadar-mheadhanairean TCA air a stiùireadh leis a’ phròiseas co-fhilleadh le bhith ag àrdachadh atherosclerosis. Gu sònraichte, is dòcha gum bi feum air àrdachadh ann am PCx gus iarrtas nas motha airson searbhag aspartic a chumail suas, rud a thathar a’ moladh ann an ceallan a tha a’ iomadachadh le mì-ghnìomhachd mitochondrial (45). Ach, cha do nochd ar mion-sgrùdadh metabolomics atharrachaidhean mòra sam bith ann an ìre seasmhach searbhag aspartic ann am PNs Mfn2cKO (Figear S6A), a tha a rèir coltais a’ nochdadh an cleachdadh metabolach eadar-dhealaichte de searbhag aspartic eadar ceallan a tha a’ iomadachadh agus neurons iar-mitotic. Ged nach eil an dearbh dhòigh-obrach airson àrdachadh PCx ann an neurons mì-ghnìomhach in vivo air a chomharrachadh fhathast, sheall sinn gu bheil pàirt chudromach aig an fhreagairt ro-luath seo ann a bhith a’ cumail suas staid redox neurons, a chaidh a nochdadh ann an deuchainnean FLIM air sliseagan cerebellar. Gu sònraichte, faodaidh casg a chuir air PNs bho bhith ag àrdachadh PCx leantainn gu staid nas oxidichte agus bàs cealla a luathachadh. Chan eil gnìomhachadh lobhadh BCAA agus carboxylation pyruvate nan dòighean air figheagan iomaill mì-ghnìomhachd mitochondrial a chomharrachadh (7). Mar sin, tha coltas gur e prìomh fheart a th’ annta de neurons aig a bheil gainnead OXPHOS, eadhon ged nach e an aon fheart a th’ annta, a tha cudromach airson neuro-chrìonadh.
'S e seòrsa eadar-dhealaichte de ghalar neurodegenerative a th' ann an galar cerebellar a bhios mar as trice a' nochdadh mar ataxia agus gu tric a' dèanamh cron air PNan (46). Tha an sluagh neuron seo gu sònraichte so-leònte ri mì-ghnìomhachd mitochondrial leis gu bheil an crìonadh roghnach ann an luchagan gu leòr airson mòran de na comharran motair a tha a' comharrachadh ataxia spinocerebellar daonna ath-riochdachadh (16, 47, 48). A rèir aithisgean, tha modail luchaige transgenic le gine mutant co-cheangailte ri ataxia spinocerebellar daonna agus tha mì-ghnìomhachd mitochondrial aige (49, 50), a' cur cuideam air cho cudromach 's a tha e sgrùdadh a dhèanamh air builean easbhaidh OXPHOS ann am PNPH. Mar sin, tha e gu sònraichte freagarrach an sluagh neuron sònraichte seo a sgaradh agus a sgrùdadh gu h-èifeachdach. Ach, leis gu bheil PNan gu math mothachail air cuideam agus a' dèanamh suas cuibhreann ìosal den t-sluagh cealla cerebellar gu lèir, airson mòran sgrùdaidhean stèidhichte air omics, tha dealachadh roghnach dhiubh mar cheallan slàn fhathast na thaobh dùbhlanach. Ged a tha e cha mhòr do-dhèanta dìth iomlan truailleadh a choileanadh ann an seòrsachan cealla eile (gu h-àraidh clò inbheach), chuir sinn ceum dealachaidh èifeachdach còmhla ri FACS gus àireamh gu leòr de neurons beòthail fhaighinn airson mion-sgrùdadh proteomics sìos an abhainn, agus tha còmhdach pròtain gu math àrd againn (mu 3000 pròtain) an taca ris an t-seata dàta a th’ ann mar-thà den cherebellum gu lèir (51). Le bhith a’ gleidheadh ​​beòthalachd cheallan slàn, leigidh an dòigh a bheir sinn seachad an seo leinn chan ann a-mhàin sgrùdadh a dhèanamh air na h-atharrachaidhean anns na slighean metabolach anns na mitochondria, ach cuideachd sgrùdadh a dhèanamh air na h-atharrachaidhean anns na co-aoisean cytoplasmic aige, a tha a’ cur ri cleachdadh tagaichean membran mitochondrial gus seòrsa cealla a neartachadh An dòigh ùr airson àireamh nam mitochondria ann an clò iom-fhillte (52, 53). Chan eil an dòigh a tha sinn a’ toirt cunntas air dìreach co-cheangailte ri sgrùdadh cheallan Purkinje, ach faodar a chur an sàs gu furasta ann an seòrsa sam bith de chealla gus dèiligeadh ri atharrachaidhean metabolach ann an eanchainn tinn, a’ gabhail a-steach modalan eile de mhì-ghnìomhachd mitochondrial.
Mu dheireadh, tha sinn air uinneag leigheasach a chomharrachadh rè a’ phròiseis ath-eagrachaidh metabolach seo a dh’ fhaodas prìomh shoidhnichean cuideam ceallach a thionndadh air ais gu tur agus casg a chuir air crìonadh neuronal. Mar sin, dh’ fhaodadh tuigse air buaidhean gnìomhach an ath-uèirleachaidh a tha air a mhìneachadh an seo lèirsinn bhunasach a thoirt seachad air leigheasan a dh’ fhaodadh a bhith ann airson comas-beò neuronal a chumail suas rè mì-ghnìomhachd mitochondrial. Tha feum air rannsachadh san àm ri teachd a tha ag amas air atharrachaidhean ann am metabolism lùtha ann an seòrsachan cealla eanchainn eile a sgrùdadh gus làn chur an sàs a’ phrionnsapail seo ann an galairean neurolach eile fhoillseachadh.
Chaidh luchagan MitoPark a mhìneachadh roimhe (31). Chaidh luchagan C57BL/6N le ginean Mfn2 ri taobh loxP a mhìneachadh roimhe (18) agus chaidh an croiseadh le luchagan L7-Cre (23). Chaidh an sliochd dùbailte heterozygous a thig às a sin a chroiseadh an uairsin le luchagan homozygous Mfn2loxP/Mfn2loxP gus cnagadh gine sònraichte Purkinje a chruthachadh airson Mfn2 (Mfn2loxP/Mfn2loxP; L7-cre). Ann am fo-sheata de suirghe, chaidh an allele Gt (ROSA26) SorStop-mito-YFP (stop-mtYFP) a thoirt a-steach tro chroisidhean a bharrachd (20). Chaidh a h-uile modh-obrach bheathaichean a dhèanamh a rèir stiùiridhean Eòrpach, nàiseanta agus institiùideach agus chaidh aontachadh le LandesamtfürNatur of Umwelt and Verbraucherschutz, North Rhine-Westphalia, a' Ghearmailt. Tha obair bheathaichean cuideachd a’ leantainn stiùireadh Caidreachas Eòrpach Chomann Saidheansan Ainmhidhean Obair-lann.
Às dèidh dì-ghluasad ceirbheacsach na mnà a tha trom le leanabh a thoirt a-steach do dhì-ghluasad, tha embryo na luchaige air a sgaradh a-mach (E13). Chaidh an cortex a sgaradh ann am Fuasgladh Salainn Chothromach Hanks (HBSS) le 10 mM Hepes air a chur ris agus a thoirt air adhart gu Meadhan Iolaire Atharraichte Dulbecco anns a bheil papain (20 U/ml) agus cysteine ​​(1μg/ml). Goir an clò ann an DMEM) agus dealaich e le cnàmhadh einsímeach. Ml) aig 37°C airson 20 mionaid, agus an uairsin air a mhuileann gu meacanaigeach ann an DMEM le 10% serum fetal bovine air a chur ris. Chaidh ceallan a chur air còmhdach glainne còmhdaichte le polylysine aig dùmhlachd de 2 × 106 gach mias cultar 6 cm no aig dùmhlachd de 0.5 × 105 ceallan / cm2 airson mion-sgrùdadh ìomhaighean. Às dèidh 4 uairean a thìde, chaidh am meadhan a chuir na àite le meadhan saor bho serum Neurobasal anns a bheil 1% de leasachan B27 agus 0.5 mM GlutaMax. Chaidh na niùronan an uair sin a chumail aig 37°C agus 5% CO2 tron ​​deuchainn, agus chaidh am biathadh aon uair san t-seachdain. Gus ath-chur air adhart in vitro, chaidh 3μl (mias cultar 24-tobar) no 0.5μl (plàta 24-tobar) den vectar bhìoras AAV9 a leanas a chleachdadh gus niùronan a làimhseachadh air an dàrna latha in vitro: AAV9.CMV.PI.eGFP. WPRE.bGH (Addgene, àireamh catalog 105530-AAV9) agus AAV9.CMV.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40 (Addgene, àireamh catalog 105545-AAV9).
Tha DNA co-phàirteach Mfn1 agus Mfn2 luchaige (air fhaighinn bho phlasmaid Addgene #23212 agus #23213, fa leth) air a chomharrachadh leis an t-sreath V5 (GKPIPNPLLGLDST) aig an C-terminus, agus tha iad air an ceangal ri mCherry san fhrèam tron ​​t-sreath T2A. 'S e tiodhlac bho Heidelberg TP Dick DFKZ (Deutsches Krebsforschungszentrum) a th' ann an Grx1-roGFP2. Le bhith a' cur an àite a' chaiseid tdTomato a' cleachdadh dhòighean clònaidh àbhaisteach, chaidh an caiseid ath-chlònadh a-steach do chnàimh-droma pAAV-CAG-FLEX-tdTomato (àireamh fiosrachaidh Addgene 28306) gus vectaran pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5, pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN1-V5 agus pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 a chruthachadh. Chaidh ro-innleachd coltach ris a chleachdadh gus am vectar smachd pAAV-CAG-FLEX-mCherry a chruthachadh. Gus an togail AAV-shPCx a chruthachadh, tha feum air vectar plasmid AAV (VectorBuilder, pAAV [shRNA] -CMV-mCherry-U6-mPcx- [shRNA # 1]), anns a bheil an sreath DNA a tha a’ còdachadh an shRNA a tha ag amas air PCx ​​luchaige (5′CTTTCGCTCTAAGGTGCTAAACTCGAGTTTAGCACCTTAGAGCGAAAG 3′). Fo smachd an neach-adhartachaidh U6, thathar a’ cleachdadh mCherry fo smachd an neach-adhartachaidh CMV. Chaidh cinneasachadh vectaran AAV co-phàirteach a dhèanamh a rèir stiùiridhean an neach-dèanamh (Cell Biolabs). Ann an ùine ghoirid, cleachd plasmid gluasaid a’ giùlan mCherry-T2A-MFN2-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5), mCherry-T2A-MFN1-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) gu sealach Tar-chur gine còdaidh 293AAV-T2A-MFN1-V5), mCherry (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) no Grx-roGFP2 (pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2), a bharrachd air pròtain capsid AAV1 a chòdachadh agus pròtain co-phàirteach Plasmid pacaidh, a’ cleachdadh dòigh calcium phosphate. Fhuaireadh an t-supernatant amh bhìoras le bhith a’ cleachdadh cearcallan reothadh-leaghadh ann an amar deigh tioram / ethanol agus chaidh na ceallan a lysis ann an saline bufaire fosfáit (PBS). Chaidh am vectar AAV a ghlanadh le ultra-centrifugation neo-leantainneach le iodixanol (24 uair aig 32,000 rpm agus 4°C) agus chaidh a dhùmhlachadh le bhith a’ cleachdadh criathrag ceudrifugal Amicon ultra-15. Chaidh tiotar genome AAV1-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5 [2.9 × 1013 leth-bhreac genome (GC) / ml], AAV1-CAG-FLEX-mCherry (6.1 × 1012 GC / ml), AAV1-CAG-FLEX mar a chaidh a mhìneachadh roimhe (54), air a thomhas le PCR cainneachdail fìor-ùine (qPCR) -MFN1-V5 (1.9 × 1013 GC / ml) agus AAV1-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 (8.9 × 1012 GC / ml).
Chaidh prìomh niùronan a sgrìobadh dheth ann am PBS 1x fuar-deighe, an cur ann am peileagan, agus an uairsin an co-dhèanamh ann am bufair lysis 0.5% Triton X-100 / 0.5% sodium deoxycholate/PBS anns an robh phosphatase agus protease inhibitor (Roche). Chaidh tomhas pròtain a dhèanamh le bhith a’ cleachdadh an deuchainn searbhag bicinchoninic (Thermo Fisher Scientific). Chaidh na pròtainean an uairsin a sgaradh le electrophoresis gel SDS-polyacrylamide, agus an uairsin an cur air membran polyvinylidene fluoride (GE Healthcare). Cuir bacadh air làraichean neo-shònraichte agus goir leis a’ phrìomh antibody (faic Clàr S1 airson mion-fhiosrachadh) ann am bainne 5% ann an TBST (saline Tris-buffered le Tween), ceumannan nighe agus antibody àrd-sgoile ann an TBST Incubate. Goir leis a’ phrìomh antibody thar oidhche aig +4°C. Às deidh nighe, cuir an dàrna antibody an sàs airson 2 uair a thìde aig teòthachd an t-seòmair. Às deidh sin, le bhith a’ goir an aon blot le antibody anti-β-actin, chaidh an aon luchdachadh a dhearbhadh. Lorgaireachd le bhith ag atharrachadh gu chemiluminescence agus a’ neartachadh chemiluminescence (GE Healthcare).
Chaidh na neuronan a chaidh a chur roimhe air còmhdach-slipichean glainne a dhaingneachadh le 4% paraformaldehyde (PFA)/PBS aig an àm shònraichte aig teòthachd an t-seòmair airson 10 mionaidean. An toiseach, tha na còmhdach-slipichean air an lìonadh le 0.1% Triton X-100/PBS airson 5 mionaidean aig teòthachd an t-seòmair, agus an uairsin ann am bufair bacadh [3% albumin serum bovine (BSA)/PBS]. Air an dàrna latha, chaidh na còmhdach-slipichean a nighe le bufair bacadh agus an goir leis an antibody àrd-sgoile fluorophore-conjugated iomchaidh airson 2 uair a thìde aig teòthachd an t-seòmair; mu dheireadh, chaidh na sampallan a nighe gu mionaideach ann am PBS le 4′,6-diamidino-2-Phenylindole (DAPI) air a cho-dhath agus an uairsin air a dhaingneachadh air an t-sleamhnag miocroscop le Aqua-Poly/Mount.
Chaidh luchagan (fireann is boireann) a thoirt a-steach do dh’anesthesia le stealladh intraperitoneal de ketamine (130 mg/kg) agus xylazine (10 mg/kg) agus chaidh an toirt seachad fon chraiceann le analgesic carprofen (5 mg/kg), agus chaidh an cur ann an ionnsramaid stereotactic (Kopf) uidheamaichte le pada blàth. Nochd an claigeann agus cleachd drile fiaclaireachd gus am pàirt den cortex cerebellar a tha a’ freagairt ris a’ chnàimh mis (bho lambda: earball 1.8, lateral 1, a tha a’ freagairt ri lobules IV agus V) a thanachadh. Cleachd snàthad steallaire lùbte gus toll beag a chruthachadh gu faiceallach anns a’ chlaigeann gus nach cuir thu dragh air an t-siostam vascular gu h-ìosal. An uairsin thèid an capillary glainne tana a chuir a-steach gu slaodach a-steach don mhicro-tholl (bho -1.3 gu -1 air taobh ventral an dura mater), agus thèid 200 gu 300 nl AAV a stealladh a-steach don mhicro-injector (Narishige) le steallairean làimhe (Narishige) grunn thursan aig cuideam ìosal thar ùine uinneag 10 gu 20 mionaid. Às dèidh an stealladh, cuir an capillary airson 10 mionaidean eile gus leigeil leis a’ bhìoras sgaoileadh gu tur. Às dèidh na capillaries a thoirt air falbh, tha an craiceann air a fuaigheal gu faiceallach gus sèid anns na lotan a lughdachadh agus leigeil leis a’ bheathach faighinn seachad air. Chaidh na beathaichean a làimhseachadh le faochadh pian (caspofen) airson grunn làithean às dèidh an obrachaidh, agus rè na h-ùine sin chaidh sùil gheur a chumail air an staid chorporra agus an uairsin chaidh an cur gu bàs aig an àm ainmichte. Chaidh a h-uile modh-obrach a dhèanamh a rèir stiùiridhean Eòrpach, nàiseanta agus institiùideach agus chaidh an aontachadh le LandesamtfürNatur of Umwelt and Verbraucherschutz, North Rhine-Westphalia, a’ Ghearmailt.
Chaidh na beathaichean a thoirt fo anesthetis le ketamine (100 mg/kg) agus xylazine (10 mg/kg), agus chaidh an cridhe a phumpadh le 0.1 M PBS an toiseach, agus an uairsin le 4% PFA ann am PBS. Chaidh an clò a sgaradh agus a dhaingneachadh ann an 4% PFA/PBS thar oidhche aig 4°C. Chaidh sgian chreathaidh (Leica Microsystems GmbH, Vienna, an Ostair) a chleachdadh gus earrannan sagittal (50 μm de thighead) ullachadh bhon eanchainn dhaingnichte ann am PBS. Mura h-eilear ag ràdh a chaochladh, chaidh dathadh nan earrannan saor-fleòdraidh a dhèanamh mar a chaidh a mhìneachadh gu h-àrd (13) aig teòthachd an t-seòmair agus gan gluasad. Ann an ùine ghoirid, an toiseach, chaidh na sliseagan a fhuaireadh a dhèanamh treòite le 0.5% Triton X-100/PBS airson 15 mionaidean aig teòthachd an t-seòmair; airson cuid de epitopes (Pcx agus Shmt2), le bhith ann am bufair tris-EDTA aig 80°C (PH 9) a’ teasachadh nan sliseagan airson 25 mionaidean an àite a’ cheum seo. An uair sin, chaidh na h-earrannan a ghoir le prìomh antibody (faic Clàr S1) ann am bufair bacaidh (3% BSA/PBS) aig 4°C thar oidhche le measgachadh. An ath latha, chaidh na h-earrannan a nighe le bufair bacaidh agus an goir leis an dàrna antibody iomchaidh ceangailte ri fluorophore airson 2 uair a thìde aig teòthachd an t-seòmair; mu dheireadh, chaidh na h-earrannan a nighe gu mionaideach ann am PBS, an aghaidh-dhath le DAPI, agus an uairsin an daingneachadh le AquaPolymount air sleamhnag miocroscop.
Chaidh miocroscop confocal sganaidh leusair (TCS SP8-X no TCS Digital Light Sheet, Leica Microsystems) uidheamaichte le leusair solais gheal agus leusair ultraviolet 405 diode a chleachdadh gus an sampall a dhealbhadh. Le bhith a’ brosnachadh am fluorophore agus a’ cruinneachadh an t-soidhne le Hybrid Detector (HyDs), chaidh bathar-bog LAS-X a chleachdadh gus ìomhaighean cruachta a chruinneachadh a bha a rèir samplachadh Nyquist ann am modh sreathmhor: airson pannalan neo-chainneachdail, is e comharran fìor dhinimigeach a th’ ann (mar eisimpleir, ann an ceallan somatic agus dendrites) (mtYFP) Cleachd HyD gus an àireamh de PNn a lorg ann am modh BrightR). Tha geatachadh bho 0.3 gu 6 ns air a chur an sàs gus an cùl-raon a lughdachadh.
Dealbhan fìor-ùine de cheallan seòrsaichte. Às dèidh an seòrsachadh ann am meadhan Neurobasal-A anns an robh 1% de stuth-cuideachaidh B27 agus 0.5 mM GlutaMax, chaidh na ceallan a chur sa bhad air sleamhnagan glainne còmhdaichte le poly-l-lysine (μ-Slide8 Well, Ibidi, àireamh catalog 80826), agus an uairsin gan cumail aig 37°C agus 5% CO2 airson 1 uair a thìde gus leigeil leis na ceallan socrachadh. Chaidh dealbhan fìor-ùine a dhèanamh air miocroscop sganaidh laser Leica SP8 le laser geal, HyD, lionsa amas ola 63 × [1.4 àireamhach fosgladh (NA)] agus àrd-ùrlar teasachaidh.
Chaidh an luchag a thoirt fo anesthesia gu sgiobalta le carbon dà-ogsaid agus a ceann a thoirt dheth, chaidh an eanchainn a thoirt a-mach às a’ chlaigeann gu sgiobalta, agus a ghearradh ann an earrann sagittal 200μm de thighead (airson deuchainn lipéadaidh 13C) no 275μm de thighead (airson deuchainnean dà photon) air a lìonadh leis na stuthan a leanas. Tha an reòiteag (HM-650 V, Thermo Fisher Scientific, Walldorf, a’ Ghearmailt) air a lìonadh leis na stuthan a leanas: 125 mM NaCl deigh-fhuar, shàthaichte le carbon (95% O2 agus 5% CO2) ìosal ann an Ca2 + lionn cerebrospinal fuadain (ACSF), 2.5 mM KCl, bufair sodium phosphate 1.25 mM, 25 mM NaHCO3, 25 mM glùcois, 0.5 mM CaCl2 agus 3.5 mM MgCl2 (cuideam osmotic de 310 gu 330 mmol). Gluais na slisneagan eanchainn a fhuaireadh gu seòmar ro-ghoir anns a bheil Ca2 + ACSF nas àirde (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM bufair sodium phosphate, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-glùcois, 1.0 mM CaCl2 agus 2.0 mM MgCl2) Meadhanach) pH 7.4 agus 310 gu 320 mmol).
Rè a’ phròiseis ìomhaighean, chaidh na sliseagan a ghluasad gu seòmar ìomhaighean sònraichte, agus chaidh an deuchainn a dhèanamh fo shruthadh leantainneach ACSF aig teòthachd cunbhalach eadar 32° agus 33°C. Chaidh miocroscop sganaidh laser ioma-photon (TCS SP8 MP-OPO, Leica Microsystems) uidheamaichte le lionsa amas Leica 25x (NA 0.95, uisge), laser Ti: Sapphire (Chameleon Vision II, Coherent) a chleachdadh airson ìomhaighean sliseagan. Modúl FLIM (PicoHarp300, PicoQuant).
FLIM de Grx1-roGFP2. Chaidh na h-atharrachaidhean ann an staid redox siotoplasmach PNan a thomhas le FLIM dà-photon ann an sliseagan eanchainn sagittal, far an robh am biosensor Grx1-roGFP2 ag amas air PNan. Anns an t-sreath PN, tha an raon togail air a thaghadh mu 50 gu 80 μm fo uachdar na slise gus dèanamh cinnteach gu bheil PN obrachail ann (is e sin, dìth structar grìogagach no atharrachaidhean morf-eòlach neuronal air feadh nan dendrites) agus an sensor roGFP2 dùbailte deimhinneach agus shRNA còdachadh AAV PCx no an t-sreath smachd aige (gach fear a’ co-chur an cèill mCherry). Cruinnich ìomhaighean aon-chruach le zoom didseatach 2x [tonn-fhaid brosnachaidh: 890 nm; 512 nm 512 piogsail]. Lorg: thathas a’ cleachdadh HyD a-staigh, buidheann sìoltachain fluorescein isothiocyanate (FITC)] agus cuibheasachd ìomhaigh taobh a-staigh 2 gu 3 mionaidean gus dèanamh cinnteach gu bheil gu leòr fotonan air an cruinneachadh (1000 foton gu h-iomlan) airson freagairt lùb. Chaidh cugallachd a’ phròba Grx1-roGFP2 agus dearbhadh nan suidheachaidhean FLIM a dhèanamh le bhith a’ cumail sùil air luach fad-beatha roGFP2 nuair a chaidh 10 mM H2O2 exogenous a chur ris an ACSF perfusion (gus oxidation a mheudachadh, agus mar thoradh air sin fad-beatha nas fhaide), agus an uairsin 2 mM dithiothreitol a chur ris (a’ lughdachadh ìre an lughdachadh, agus mar thoradh air sin lùghdachadh ann am fad-beatha) (Figear S8, D gu G). Cleachd bathar-bog FLIMfit 5.1.1 gus na toraidhean a fhuaireadh a sgrùdadh, cuir an lùb crìonaidh eas-chruthach singilte den ìomhaigh gu lèir ris an IRF a chaidh a thomhas (gnìomh freagairt ionnstramaid), agus tha χ2 timcheall air 1. Gus fad-beatha aon PN obrachadh a-mach, chaidh am masg timcheall air a’ bhodhaig nearbhach a tharraing le làimh, agus chaidh an ùine-beatha chuibheasach anns gach masg a chleachdadh airson tomhas.
Mion-sgrùdadh comas mitochondrial. Às dèidh don earrann gheur a bhith air a goir le 100 nM TMRM air a chur gu dìreach ris an ACSF a chaidh a phumpadh airson 30 mionaid, chaidh na h-atharrachaidhean ann an comas mitochondrial de PNan a thomhas le miocroscop dà-photon. Chaidh ìomhaighean TMRM a dhèanamh le bhith a’ brosnachadh a’ phròba aig 920 nm agus a’ cleachdadh HyD a-staigh (tetramethylrhodamine isothiocyanate: 585/40 nm) gus comharran a chruinneachadh; le bhith a’ cleachdadh an aon tonn-fhaid brosnachaidh ach a’ cleachdadh HyD a-staigh eadar-dhealaichte (FITC: 525/50) gus ìomhaigh a dhèanamh de mtYFP. Cleachd plugan Àireamhair Ìomhaigh ImageJ gus comas mitochondrial a mheasadh aig ìre cealla singilte. Ann an ùine ghoirid, thathas a’ cleachdadh a’ cho-aontar plugan: comharra = min (mtYFP, TMRM) gus an roinn mitochondrial a chomharrachadh a sheallas an comharra TMRM ann am Purkinje Somali anns an ìomhaigh confocal aon-chruach den t-sianal co-fhreagarrach. An uairsin thèid an raon piogsail anns a’ masg a thig às a thomhas, agus an uairsin thèid a dhèanamh àbhaisteach air an ìomhaigh aon-chruach stairsneach co-fhreagarrach den t-sianal mtYFP gus am bloigh mitochondrial fhaighinn a’ sealltainn comas mitochondrial.
Chaidh an ìomhaigh a dhì-cho-fhillteachadh le bathar-bog Huygens Pro (Scientific Volume Imaging). Airson na dealbhan sganaichte de leacan, thèid montage de aon leac a dhèanamh a’ cleachdadh an algairim fuaigheil fèin-ghluasadach a tha air a thoirt seachad le bathar-bog LAS-X. Às dèidh calabrachadh ìomhaigh, cleachd ImageJ agus Adobe Photoshop gus an ìomhaigh a phròiseasadh tuilleadh agus an soilleireachd agus an co-mheas atharrachadh gu cothromach. Cleachd Adobe Illustrator airson ullachadh grafaigeach.
Mion-sgrùdadh fòcas mtDNA. Chaidh àireamh nan lotan mtDNA a thomhas air earrannan cerebellar air an robh bileagan antibodies an aghaidh DNA le miocroscop confocal. Chaidh gach raon targaid a chruthachadh airson corp na cealla agus niùclas gach cealla, agus chaidh an raon fa leth obrachadh a-mach a’ cleachdadh am plugan Multi Measure (bathar-bog ImageJ). Thoir air falbh an raon niùclasach bhon raon corp na cealla gus an raon cytoplasmach fhaighinn. Mu dheireadh, chaidh am plugan Analyze Particles (bathar-bog ImageJ) a chleachdadh gus na puingean DNA cytoplasmach a’ comharrachadh mtDNA air an ìomhaigh stairsnich a thomhas gu fèin-ghluasadach, agus chaidh na toraidhean a fhuaireadh a dhèanamh àbhaisteach gu cuibheasachd PN luchagan CTRL. Tha na toraidhean air an cur an cèill mar an àireamh chuibheasach de niùclasaidean gach cealla.
Mion-sgrùdadh air abairt pròtain. Cleachd plugan Àireamhair Ìomhaigh ImageJ gus abairt pròtain ann am PN a mheasadh aig ìre cealla singilte. Ann an ùine ghoirid, anns an ìomhaigh confocal aon-fhilleadh den t-sianal co-fhreagarrach, tron ​​cho-aontar: comharra = min (mtYFP, antibody), tha an roinn mitochondrial a tha a’ sealltainn imdhíonachd-fhreagairt do antibody sònraichte ann am Purkina air a chomharrachadh. An uairsin tha an raon piogsail anns a’ masg a thig às air a thomhas, agus an uairsin air a dhèanamh àbhaisteach air an ìomhaigh aon-chruach stairsneach co-fhreagarrach den t-sianal mtYFP gus an co-mheas mitochondrial den phròtain a tha air a thaisbeanadh fhaighinn.
Mion-sgrùdadh dùmhlachd cheallan Purkinje. Chaidh am plugan Cell Counter de ImageJ a chleachdadh gus dùmhlachd Purkinje a mheasadh le bhith a’ roinn àireamh nan ceallan Purkinje a chaidh an cunntadh le fad fàinne an cerebellar anns a bheil na ceallan a chaidh an cunntadh.
Ullachadh is cruinneachadh shamhlaichean. Chaidh eanchainn a’ bhuidheann smachd agus luchagan Mfn2cKO a shocrachadh ann an 2% PFA/2.5% glutaraldehyde ann am bufair fosfáit 0.1 M (PB), agus an uairsin chaidh earrannan coronal ullachadh a’ cleachdadh ciliates (Leica Mikrosysteme GmbH, Vienna, an Ostair) (tiugh 50 gu 60 μm). An uairsin chaidh an socrachadh ann am bufair PB ann an 1% os tetraoxide agus 1.5% potasium ferrocyanide aig teòthachd an t-seòmair airson 1 uair a thìde. Chaidh na h-earrannan a nighe trì tursan le uisge grùide, agus an uairsin an dath le 70% ethanol anns an robh 1% uranyl acetate airson 20 mionaid. An uairsin chaidh na h-earrannan a dhì-uisgeachadh ann an deoch làidir ìreichte agus an cur a-steach ann an roisinn epocsa Durcupan ACM (roisinn tilgeadh Araldite M) (Electron Microscopy Sciences, àireamh catalog 14040) eadar sleamhnagan glainne còmhdaichte le silicon, agus mu dheireadh aig 60°C poilimearachadh san àmhainn airson 48 uairean. Chaidh an raon cortex cerebellar a thaghadh agus chaidh earrannan tana 50 nm a ghearradh air Leica Ultracut (Leica Mikrosysteme GmbH, Vienna, an Ostair) agus an taghadh air griod sliotan copair 2 × 1 mm còmhdaichte le film polystyrene. Chaidh na h-earrannan a dhath le fuasgladh de 4% uranyl acetate ann an H2O airson 10 mionaidean, an nighe le H2O grunn thursan, an uairsin le Reynolds luaidhe citrate ann an H2O airson 10 mionaidean, agus an uairsin an nighe le H2O grunn thursan. Chaidh micreagrafan a thogail le miocroscop tar-chuir dealanach Philips CM100 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) a’ cleachdadh camara didseatach TVIPS (Tietz Video and Image Processing System) TemCam-F416 (TVIPS GmbH, Gauting, USA). A’ Ghearmailt).
Airson luchagan air an robh AAV, chaidh an eanchainn a sgaradh agus a shlisneachadh ann an earrann sagittal 1 mm de thighead, agus chaidh an cerebellum a sgrùdadh le bhith a’ cleachdadh miocroscop fluorescence gus an fhàinne air an robh AAV air a ghlacadh (is e sin, a’ cur an cèill mCherry) a chomharrachadh. Chan eil ach deuchainnean anns a bheil stealladh AAV ag adhbhrachadh èifeachdas tar-chuir glè àrd de shreath cealla Purkinje (ie cha mhòr an t-sreath gu lèir) ann an co-dhiù dà fhàinne cerebellar às deidh a chèile air an cleachdadh. Chaidh an lùb tar-chuir AAV a mhicro-dhisecteadh airson thar oidhche às deidh a dhaingneachadh (4% PFA agus 2.5% glutaraldehyde ann am bufair cocoate 0.1 M) agus chaidh a phròiseasadh tuilleadh. Airson leabachadh EPON, chaidh an clò stèidhichte a nighe le bufair sodium cocoate 0.1 M (Applichem), agus a ghoir le 2% OsO4 (os, Science Services; Caco) ann am bufair sodium cocoate 0.1 M (Applichem) 4 uairean a thìde, agus an uairsin nigh airson 2 uair a thìde. Dèan a-rithist 3 tursan le bufair cocamide 0.1 M. Às dèidh sin, chaidh an t-sreath dìreadh de ethanol a chleachdadh gus gach fuasgladh ethanol a ghoir aig 4°C airson 15 mionaidean gus an stuth a dhì-uisgeachadh. Chaidh an stuth a ghluasad gu propylene oxide agus a ghoir thar oidhche ann an EPON (Sigma-Aldrich) aig 4°C. Cuir an stuth ann an EPON ùr aig teòthachd an t-seòmair airson 2 uair a thìde, agus an uairsin cuir a-steach e aig 62°C airson 72 uair a thìde. Cleachd ultramicrotome (Leica Microsystems, UC6) agus sgian daoimean (Diatome, Biel, an Eilbheis) gus earrannan ultrathane 70 nm a ghearradh, agus stain le 1.5% uranyl acetate airson 15 mionaidean aig 37°C, agus stain le fuasgladh luaidhe citrate 4 mionaidean. Chaidh na micrographs dealanach a thogail a’ cleachdadh microscop dealanach tar-chuir JEM-2100 Plus (JEOL) uidheamaichte le Camera OneView 4K 16-bit (Gatan) agus bathar-bog DigitalMicrograph (Gatan). Airson mion-sgrùdadh, chaidh micreagrafan dealanach fhaighinn le zoom didseatach 5000× no 10,000×.
Mion-sgrùdadh morf-eòlach air mitochondria. Airson a h-uile mion-sgrùdadh, chaidh cumaidhean nam mitochondria fa leth a mhìneachadh le làimh ann an ìomhaighean didseatach a’ cleachdadh bathar-bog ImageJ. Tha paramadairean morf-eòlach eadar-dhealaichte air an sgrùdadh. Tha dùmhlachd mitochondrial air a chur an cèill mar cheudad a gheibhear le bhith a’ roinn farsaingeachd iomlan mitochondrial gach cealla leis an raon cytoplasm (farsaingeachd cytoplasm = farsaingeachd cealla-farsaingeachd niùclas cealla) × 100. Tha cruinn-chruth mitochondria air a thomhas leis an fhoirmle [4π∙(farsaingeachd/cearcall-thomhas 2)]. Chaidh morf-eòlas ista mitochondria a sgrùdadh agus a roinn ann an dà roinn (“tiùbalach” agus “blister”) a rèir am prìomh chumaidhean.
Mion-sgrùdadh air àireamh is dùmhlachd autophagosome/lysosome. Cleachd bathar-bog ImageJ gus cumaidhean gach autophagosome/lysosome a mhìneachadh le làimh san ìomhaigh dhidseatach. Tha farsaingeachd autophagosome/lysosome air a chur an cèill mar cheudad air a thomhas le bhith a’ roinn farsaingeachd iomlan structar autophagosome/lysosome gach cealla leis an raon cytoplasm (farsaingeachd cytoplasm = farsaingeachd cealla-farsaingeachd niùclas) × 100. Tha dùmhlachd nan autophagosomes/lysosome air a thomhas le bhith a’ roinn an àireamh iomlan leis an àireamh de structaran autophagosome/lysosome gach cealla (a thaobh farsaingeachd cytoplasmic) (farsaingeachd cytoplasmic = farsaingeachd cealla-farsaingeachd niùclasach).
Lipéadachadh airson roinneadh géar agus ullachadh shampall. Airson deuchainnean a dh’ fheumas lipéadachadh glùcois, gluais na sliseagan eanchainn géar gu seòmar ro-ghoir, anns a bheil carbon shàthaichte (95% O2 agus 5% CO2), ACSF àrd Ca2 + (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, bufair sodium fosfáit 1.25 mM, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-glùcois, 1.0 mM CaCl2 agus 2.0 mM MgCl2, air atharrachadh gu pH 7.4 agus 310 gu 320 mOsm), anns a bheil glùcois na ionadachadh glùcois 13C6- (Eurisotop, àireamh catalog CLM-1396). Airson deuchainnean a dh’ fheumas bileagan pyruvate, gluais na sliseagan eanchainn géar gu Ca2 + ACSF nas àirde (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM bufair sodium phosphate, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-glucose, 1.0 mM CaCl2 agus cuir 2.0mM MgCl2 ris, atharraich gu pH 7.4 agus 310 gu 320mOsm), agus cuir 1mM 1-[1-13C]pyruvate (Eurisotop, àireamh catalog CLM-1082) ris. Goir na h-earrannan airson 90 mionaid aig 37°C. Aig deireadh an deuchainn, chaidh na h-earrannan a nighe gu sgiobalta le fuasgladh uisgeach (pH 7.4) anns an robh 75 mM ammonium carbonate, agus an uairsin chaidh an homogenachadh ann an 40:40:20 (v:v:v) acetonitrile (ACN): methanol: uisge. Às dèidh na h-earrannan a bhith air an goir air deigh airson 30 mionaid, chaidh na sampallan a chuir ann an inneal-snìomh aig 21,000g airson 10 mionaidean aig 4°C, agus chaidh an t-supernatant soilleir a thiormachadh ann an inneal-dùmhlachaidh SpeedVac. Chaidh am peileat metabolite tioram a thig às a stòradh aig -80°C gus an deach a sgrùdadh.
Mion-sgrùdadh cromatagrafaidheachd leaghaidh-speictreamachd mais air amino-aigéid le bileagan 13C. Airson mion-sgrùdadh cromatagrafaidheachd leaghaidh-speictreamachd mais (LC-MS), chaidh am peileat metabolite ath-fhulang ann an 75μl de dh’uisge ìre LC-MS (Honeywell). Às dèidh centrifugation aig 21,000 g airson 5 mionaidean aig 4°C, chaidh 20 μl den t-supernatant soilleirichte a chleachdadh airson mion-sgrùdadh sruthadh amino-aigéid, agus chaidh an còrr den earrann a chleachdadh sa bhad airson mion-sgrùdadh anion (faic gu h-ìosal). Chaidh mion-sgrùdadh amino-aigéid a dhèanamh a’ cleachdadh a’ phròtacal derivatization benzoyl chloride a chaidh a mhìneachadh roimhe (55, 56). Anns a’ chiad cheum, chaidh 10μl de 100 mM sodium carbonate (Sigma-Aldrich) a chur ri 20μl de earrann metabolite, agus an uairsin chaidh 10μl de 2% benzoyl chloride (Sigma-Aldrich) a chur ris an ACN ìre LC. Chaidh an sampall a mheasgachadh goirid le vortex agus an uair sin a chuir ann an centrifuge aig 21,000 g airson 5 mionaidean aig 20 ° C. Gluais an supernatant glan gu fiol autosampler 2 ml le cuir a-steach glainne cònail (meud 200 μl). Chaidh na sampallan a sgrùdadh a’ cleachdadh siostam LC ultra-àrd-choileanaidh Acquity iClass (Waters) ceangailte ris an speactrometer mais mionaideachd àrd-rùn Q-Exactive (QE)-HF (Ultra High Field Orbitrap) (Thermo Fisher Scientific). Airson mion-sgrùdadh, chaidh 2 μl den sampall derivatived a stealladh a-steach do cholbh silica T3 àrd-neart 100 × 1.0 mm (Waters) anns a bheil mìrean 1.8 μm. Is e an ìre sruthadh 100 μl / min, agus tha an siostam bufair air a dhèanamh suas de bufair A (10 mM ammonium formate agus 0.15% searbhag formach ann an uisge) agus bufair B (ACN). Tha an caisead mar a leanas: 0% B aig 0 mionaidean; 0% B. 0 gu 15% B aig 0 gu 0.1 mionaidean; 15 gu 17% B aig 0.1 gu 0.5 mionaidean; B aig 17 gu 55% aig 0.5 gu 14 mionaidean; B aig 55 gu 70% aig 14 gu 14.5 mionaidean; aig 14.5 gu 70 gu 100% B aig 18 mionaidean; 100% B aig 18 gu 19 mionaidean; 100 gu 0% B aig 19 gu 19.1 mionaidean; 0% B aig 19.1 gu 28 mionaidean (55, 56). Bidh an speactrometer mais QE-HF ag obair ann am modh ianachaidh dheimhinneach le raon mais de m/z (co-mheas mais/luchd) de 50 gu 750. Is e 60,000 an rùn a chaidh a chur an sàs, agus is e 3 × 106 an targaid ian smachd buannachd (AGC) a gheibhear, agus is e 100 mìle-diogan an ùine ian as àirde. Bidh an stòr ianachaidh electrospray teasachaidh (ESI) ag obair aig bholtaids spraeraidh de 3.5 kV, teòthachd capillary de 250 ° C, sruth-adhair slige de 60 AU (aonadan neo-riaghailteach), agus sruth-adhair taiceil de 20 AU. 250 ° C. Tha an lionsa S air a shuidheachadh gu 60 AU.
Mion-sgrùdadh cròmatagrafaidheachd anion-MS air searbhagan organach le bileagan 13C. Chaidh an deascadh metabolite a bha air fhàgail (55μl) a sgrùdadh le bhith a’ cleachdadh siostam cròmatagrafaidheachd ian Dionex (ICS 5000+, Thermo Fisher Scientific) ceangailte ri speactrometer mais QE-HF (Thermo Fisher Scientific). Ann an ùine ghoirid, chaidh 5μl de earrann metabolite a stealladh a-steach do cholbh Dionex IonPac AS11-HC uidheamaichte le HPLC (2 mm × 250 mm, meud gràinean 4μm, Thermo Fisher Scientific) ann am modh lùb pàirteach put-a-steach le co-mheas lìonaidh de 1.) Colbh dìon Dionex IonPac AG11-HC (2 mm x 50 mm, 4μm, Thermo Fisher Scientific). Tha teòthachd a’ cholbh air a chumail aig 30 ° C, agus tha an autosampler air a shuidheachadh gu 6 ° C. Cleachd cartus potasium hydroxide air a thoirt seachad le uisge dì-ionichte gus caisead potasium hydroxide a chruthachadh tron ​​​​​​ghineadair eluent. Sgaradh nam metabolites aig ìre sruthadh de 380μl/min, a’ cur an caisead a leanas an sàs: 0 gu 3 mionaidean, 10 mM KOH; 3 gu 12 mionaidean, 10 gu 50 mM KOH; 12 gu 19 mionaidean, 50 gu 100 mM KOH; 19 gu 21 mionaidean, 100 mM KOH; 21 gu 21.5 mionaidean, 100 gu 10 mM KOH. Chaidh an colbh ath-chothromachadh fo 10 mM KOH airson 8.5 mionaidean.
Tha na metabolites a chaidh a sguabadh às air an cur còmhla ri sruth stuthan-leasachaidh isopropanol 150μl/min às dèidh a’ cholbh agus an uairsin air an stiùireadh gu speactrometer mais àrd-rèiteachaidh a tha ag obair ann am modh ianachaidh àicheil. Tha MS a’ cumail sùil air an raon mais bho m/z 50 gu 750 le rùn de 60,000. Tha an AGC air a shuidheachadh gu 1 × 106, agus tha an ùine ian as àirde air a chumail aig 100 ms. Chaidh an stòr ESI teasachaidh obrachadh aig bholtaids spraeraidh de 3.5 kV. Is iad na roghainnean eile den stòr ian mar a leanas: teòthachd capillary 275 ° C; sruthadh gas slige, 60 AU; sruthadh gas cuideachail, 20 AU aig 300 ° C, agus suidheachadh lionsa S gu 60 AU.
Mion-sgrùdadh dàta air metabolites le bileagan 13C. Cleachd bathar-bog TraceFinder (dreach 4.2, Thermo Fisher Scientific) airson mion-sgrùdadh dàta air co-mheas isotope. Chaidh dearbh-aithne gach todhar a dhearbhadh le todhar iomraidh earbsach agus chaidh a mhion-sgrùdadh gu neo-eisimeileach. Gus mion-sgrùdadh beairteachaidh isotope a dhèanamh, chaidh farsaingeachd a’ chromatogram ian a chaidh a thoirt a-mach (XIC) de gach isotope 13C (Mn) a thoirt a-mach à [M + H] +, far a bheil n na àireamh charboin den todhar targaid, air a chleachdadh gus amino-aigéid a sgrùdadh no [MH] + air a chleachdadh gus anionan a sgrùdadh. Tha cruinneas mais XIC nas lugha na còig pàirtean gach millean, agus tha cruinneas RT 0.05 mionaidean. Tha am mion-sgrùdadh beairteachaidh air a dhèanamh le bhith a’ tomhas co-mheas gach isotope a chaidh a lorg ri suim nan isotopes uile den todhar co-fhreagarrach. Tha na co-mheasan seo air an toirt seachad mar luachan ceudad airson gach isotope, agus tha na toraidhean air an cur an cèill mar cheudad beairteachaidh molar (MPE), mar a chaidh a mhìneachadh roimhe (42).
Chaidh am peileat niùron reòta a dhèanamh co-chothromach ann am meatànól 80% reòta-fhuar (v/v), air a mheasgachadh le vortex, agus air a ghoir aig -20°C airson 30 mionaid. Measgaich an sampall le vortex a-rithist agus measgaich aig +4°C airson 30 mionaid. Chaidh an sampall a chuir ann an centrifuge aig 21,000 g airson 5 mionaidean aig 4°C, agus an uairsin chaidh an t-supernatant a thig às a chruinneachadh agus a thiormachadh le bhith a’ cleachdadh inneal-dùmhlachaidh SpeedVac aig 25°C airson mion-sgrùdadh às dèidh sin. Mar a chaidh a mhìneachadh gu h-àrd, chaidh mion-sgrùdadh LC-MS a dhèanamh air amino-aigéid nan ceallan air an seòrsachadh. A’ cleachdadh TraceFinder (dreach 4.2, Thermo Fisher Scientific), chaidh mion-sgrùdadh dàta a dhèanamh a’ cleachdadh mais monoisotopic gach todhar. Chaidh gnàthachadh cainnteach dàta metabolite a dhèanamh a’ cleachdadh am pasgan bathar-bog preprocessCore (57).
Ullachadh slisne. Chaidh an luchag a thoirt fo anesthetis gu sgiobalta le carbon dà-ogsaid agus a ceann a ghearradh dheth, chaidh an eanchainn a thoirt a-mach às a’ chlaigeann gu sgiobalta, agus chaidh an sgian chrathaidh làn deighe (HM-650 V, Thermo Fisher Scientific, Walldorf, a’ Ghearmailt) a chleachdadh gus a gearradh ann an earrannan sagittal 300 gu 375 μm. Gasachadh carbon fuar (95% O2 agus 5% CO2) Ca2 + ACSF ìosal (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM bufair sodium phosphate, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-glucose, 1.0 mM CaCl2 agus 6.0 mM MgCl2 Atharraich gu pH 7.4 agus 310 gu 330 mOsm). Gluais na sliseagan eanchainn a fhuaireadh gu seòmar anns a bheil Ca2 + ACSF nas àirde (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM bufair sodium phosphate, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-glucose, 4.0 mM CaCl2 agus mM 3.5 MgCl2) pH 7.4 agus 310 gu 320 mOsm). Stòraich na sliseagan airson 20 gu 30 mionaid gus an tèid an toirt air ais mus tèid an clàradh.
clàradh. Chaidh àrd-ùrlar miocrosgòp uidheamaichte le seòmar clàraidh stèidhichte agus lionsa amas bogaidh uisge 20x (Scientifica) a chleachdadh airson a h-uile clàradh. Chaidh na ceallan Purkinje a tha fo amharas a chomharrachadh le (i) meud a’ chuirp, (ii) àite anatamaigeach a’ cherebellum, agus (iii) abairt a’ ghine aithris fluorescent mtYFP. Tha am pìobaid paiste le strì an aghaidh bàrr de 5 gu 11 megohms air a tharraing a-mach le capillary glainne borosilicate (GB150-10, 0.86 mm × 1.5 mm × 100 mm, Science Products, Hofheim, a’ Ghearmailt) agus pìobaid chòmhnard Instruments (P-1000, Sutter), Novato, CA). Chaidh a h-uile clàradh a dhèanamh leis an ELC-03XS npi patch clamp amplifier (npi electronic GmbH, Tam, a’ Ghearmailt), a bha fo smachd a’ bhathar-bhog Signal (dreach 6.0, Cambridge Electronic, Cambridge, RA). Chaidh an deuchainn a chlàradh aig ìre samplachaidh de 12.5 kHz. Tha an comharra air a shìoladh le dà shìoltachan Bessel geàrr-pas le triceadan gearraidh de 1.3 agus 10 kHz fa leth. Tha comas na membran agus a’ phìoba air a chothromachadh leis a’ chuairt dìolaidh a’ cleachdadh an amplifier. Chaidh a h-uile deuchainn a dhèanamh fo smachd camara Orca-Flash 4.0 (Hamamatsu, Gerden, a’ Ghearmailt), a bha fo smachd bathar-bog Hokawo (dreach 2.8, Hamamatsu, Gerden, a’ Ghearmailt).
Rèiteachadh agus mion-sgrùdadh àbhaisteach air cealla slàn. Dìreach mus tèid clàradh, lìon am pìobaid leis an fhuasgladh a-staigh anns a bheil na stuthan a leanas: 4.0 mM KCl, 2.0 mM NaCl, 0.2 mM EGTA, 135.0 mM gluconat potasium, 10.0 mM Hepes, 4.0 mM ATP (Mg), 0.5 mM Guanosine triphosphate (GTP) (Na) agus 10.0 mM creatinine phosphate air an atharrachadh gu pH 7.25, agus b’ e 290 mOsm (siùcros) an cuideam osmotic. Dìreach às deidh feachd de 0 pA a chuir an sàs gus am membran a reubadh, chaidh comas fois a’ membran a thomhas. Tha an aghaidh cuir a-steach air a thomhas le bhith a’ cur sruthan hyperpolarized de -40, -30, -20, agus -10 pA an sàs. Tomhais meud freagairt a’ bholtaids agus cleachd lagh Ohm gus an aghaidh cuir a-steach obrachadh a-mach. Chaidh gnìomhachd neo-phlanaichte a chlàradh ann an clamp bholtaids airson 5 mionaidean, agus chaidh sPSC a chomharrachadh agus a thomhas ann an Igor Pro (dreach 32 7.01, WaveMetrics, Lake Oswego, Oregon, USA) a’ cleachdadh sgriobt aithneachaidh leth-fèin-ghluasadach. Tha lùb IV agus sruth seasmhach air an tomhas le bhith a’ clampadh a’ bhataraidh aig diofar chomasan (a’ tòiseachadh bho -110 mV) agus ag àrdachadh a’ bholtaids ann an ceumannan 5 mV. Chaidh cinneasachadh AP a dhearbhadh le bhith a’ cur sruth dì-phòlarachaidh an sàs. Clamp an cealla aig -70 mV fhad ‘s a tha cuisle sruth dì-phòlarachaidh ga chur an sàs. Atharraich meud ceum gach aonad clàraidh air leth (10 gu 60 pA). Obraich a-mach an tricead AP as àirde le bhith a’ cunntadh le làimh na spìcean cuisle a dh’ adhbhraicheas an tricead AP as àirde. Tha stairsneach AP air a sgrùdadh le bhith a’ cleachdadh an dàrna tùs den chuisle dì-phòlarachaidh a bhios an toiseach a’ piobrachadh aon no barrachd AP.
Rèiteachadh agus mion-sgrùdadh paiste tollta. Dèan clàradh paiste tollta a’ cleachdadh phròtacalan àbhaisteach. Cleachd pìobaid gun ATP agus GTP nach eil anns na grìtheidean a leanas: 128 mM gluconate K, 10 mM KCl, 10 mM Hepes, 0.1 mM EGTA agus 2 mM MgCl2, agus atharraich gu pH 7.2 (a’ cleachdadh KOH). Tha ATP agus GTP air an leigeil às an fhuasgladh intracellular gus casg a chuir air treòiteachd neo-riaghlaichte membran cealla. Tha am pìobaid paiste air a lìonadh le fuasgladh a-staigh anns a bheil amphotericin (timcheall air 200 gu 250μg / ml; G4888, Sigma-Aldrich) gus clàr paiste tollta fhaighinn. Chaidh amphotericin a sgaoileadh ann an dimethyl sulfoxide (dùmhlachd deireannach: 0.1 gu 0.3%; DMSO; D8418, Sigma-Aldrich). Cha robh buaidh mhòr aig dùmhlachd DMSO a chaidh a chleachdadh air na neurons a chaidh a sgrùdadh. Rè a’ phròiseis tollaidh, chaidh sùil leantainneach a chumail air an aghaidh-sianal (Ra), agus chaidh an deuchainn a thòiseachadh às deidh do leud Ra agus AP a bhith seasmhach (20-40 mionaid). Tha gnìomhachd neo-phlanaichte air a thomhas ann an clamp bholtaids agus/no sruth airson 2 gu 5 mionaidean. Chaidh mion-sgrùdadh dàta a dhèanamh a’ cleachdadh Igor Pro (dreach 7.05.2, WaveMetrics, USA), Excel (dreach 2010, Microsoft Corporation, Redmond, USA) agus GraphPad Prism (dreach 8.1.2, GraphPad Software Inc., La Jolla, CA). Na Stàitean Aonaichte). Gus APn neo-phlanaichte a chomharrachadh, thathar a’ cleachdadh plugan NeuroMatic v3.0c aig IgorPro. Comharraich APn gu fèin-ghluasadach a’ cleachdadh stairsneach sònraichte, a thèid atharrachadh leotha fhèin airson gach clàr. A’ cleachdadh an eadar-ama spìc, dearbhaich tricead na spìc leis an tricead spìc sa bhad as àirde agus an tricead spìc cuibheasach.
Dealachadh PN. Le bhith ag atharrachadh a rèir a’ phròtacal a chaidh fhoillseachadh roimhe, chaidh PNan a ghlanadh bhon cherebellum luchaige aig ìre shònraichte (58). Ann an ùine ghoirid, chaidh an cerebellum a sgaradh agus a mhion-pheantadh ann am meadhan deigh-fhuar [às aonais HBSS Ca2+ agus Mg2+, le 20 mM glùcois, penicillin (50 U/ml) agus streptomycin (0.05 mg/ml) air a chur ris], agus an uairsin am meadhan a chnàmh ann am papain [HBSS, le 1-cysteine·HCl (1 mg/ml), papain (16 U/ml) agus deoxyribonuclease I (DNase I; 0.1 mg/ml)] Làimhseachadh airson 30 mionaid aig 30°C. An toiseach, nigh na figheagan ann am meadhan HBSS anns a bheil mucus ugh (10 mg/ml), BSA (10 mg/ml) agus DNase (0.1 mg/ml) aig teòthachd an t-seòmair gus casg a chuir air cnàmhadh einsímach, agus an uairsin anns a’ mheadhan HBSS anns a bheil 20 mM glùcois. Le bhith a’ bleith gu socair ann an HBSS, leig penicillin (50 U/ml), streptomycin (0.05 mg/ml) agus DNase (0.1 mg/ml) ceallan singilte ma sgaoil. Chaidh an crochadh cealla a thig às a shìoladh tro chriathrag cealla 70μm, an uairsin chaidh na ceallan a mhilleadh le bhith gan cur ann am peileagan le bhith gan cur ann an ceudrifugation (1110 rpm, 5 mionaidean, 4°C) agus an uairsin chaidh an ath-fhulang ann am meadhan seòrsachaidh [HBSS, air a chur ri 20 mM glùcois, 20% serum fetal bovine], penicillin (50 U/ml) agus streptomycin (0.05 mg/ml)]; dèan measadh air comasachd cheallan le propidium iodide agus atharraich dùmhlachd nan ceallan gu 1 × 106 gu 2 × 106 ceallan/ml. Mus deach cytometry sruthadh a chleachdadh, chaidh an crochadh a shìoladh tro chriathrag cealla 50 μm.
Sruth-chìtomeatar. Chaidh seòrsachadh cheallan a dhèanamh aig 4°C a’ cleachdadh inneal FACSAria III (BD Biosciences) agus bathar-bog FACSDiva (BD Biosciences, dreach 8.0.1). Chaidh an crochadh cealla a sheòrsachadh le bhith a’ cleachdadh nozzle 100 μm fo chuideam de 20 psi aig ìre de ~2800 tachartas / diog. Leis nach urrainn do shlatan-tomhais geataidh traidiseanta (meud cealla, eadar-dhealachadh dà-mhodhail, agus feartan sgapadh) dèanamh cinnteach à dealachadh ceart PN bho sheòrsan cealla eile, tha an ro-innleachd geataidh air a shuidheachadh stèidhichte air coimeas dìreach dian YFP agus fèin-fhluaraiseachd ann an luchagan mitoYFP+ ​​agus mitoYFP − smachd. Tha YFP air a bhrosnachadh le bhith a’ lasadh an sampall le loidhne laser 488 nm, agus tha an comharra air a lorg le bhith a’ cleachdadh criathrag pas còmhlan 530/30 nm. Ann an luchagan mitoYFP+, thathas cuideachd a’ cleachdadh neart coimeasach a’ ghine aithris Rosa26-mitoYFP gus bloighean bodhaig neuronal agus axon aithneachadh. Tha 7-AAD air a bhrosnachadh le laser buidhe 561 nm agus air a lorg le criathrag pas-chòmhlain 675/20 nm gus ceallan marbha a thoirt a-mach. Gus astrocytes a sgaradh aig an aon àm, chaidh an crochadh cealla a dhath le ACSA-2-APC, an uairsin chaidh an sampall a rèididheachd le loidhne laser 640 nm, agus chaidh criathrag pas-chòmhlain 660/20 nm a chleachdadh gus an comharra a lorg.
Chaidh na ceallan a chaidh a chruinneachadh a dhèanamh ann am peileagan le bhith gan cur ann an centrifugation (1110 rpm, 5 mionaidean, 4°C) agus an stòradh aig -80°C gus an tèid an cleachdadh. Tha luchagan Mfn2cKO agus na cuileanan aca air an seòrsachadh air an aon latha gus atharrachadh modhan-obrach a lughdachadh. Chaidh taisbeanadh agus mion-sgrùdadh dàta FACS a dhèanamh a’ cleachdadh bathar-bog FlowJo (FlowJo LLC, Ashland, Oregon, USA).
Mar a chaidh ainmeachadh gu h-àrd (59), thathas a’ cleachdadh PCR fìor-ùine gus DNA a sgaradh bho na neuronan seòrsaichte airson tomhas mtDNA às dèidh sin. Chaidh an loidhneachd agus cugallachd stairsnich a dhearbhadh an toiseach le bhith a’ ruith qPCR air diofar àireamhan de cheallan. Ann an ùine ghoirid, cruinnich 300 PN ann am bufair lysis anns a bheil 50 mM tris-HCl (pH 8.5), 1 mM EDTA, 0.5% Tween 20 agus proteinase K (200 ng/ml) agus goir aig 55°C airson 120 mionaid. Chaidh na ceallan a ghoir tuilleadh aig 95°C airson 10 mionaidean gus dèanamh cinnteach à dì-ghnìomhachadh iomlan proteinase K. A’ cleachdadh probe TaqMan (Thermo Fisher) sònraichte do mt-Nd1, chaidh mtDNA a thomhas le PCR leth-chainnteach anns an t-siostam PCR Fìor-Ùine 7900HT (Thermo Fisher Scientific). ginean Science, àireamh catalog Mm04225274_s1), mt-Nd6 (Thermo Fisher Scientific, àireamh catalog AIVI3E8) agus 18S (Thermo Fisher Scientific, àireamh catalog Hs99999901_s1).
Ullachadh sampall proteome. Le bhith a’ teasachadh an fhuasglaidh aig 95°C airson 10 mionaidean agus ga sonicachadh, anns a’ bhufair lysis [6 M guanidine chloride, 10 mM tris(2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride, 10 mM chloroacetamide agus 100 mM tris-Lyse peileagan neuron reòta ann an HCl]. Air Bioruptor (Diagenode) airson 10 mionaidean (cuisle 30 diog / fois 30 diog). Chaidh an sampall a lagachadh 1:10 ann an 20 mM tris-HCl (pH 8.0), air a mheasgachadh le 300 ng trypsin gold (Promega), agus air a ghoir thar oidhche aig 37°C gus cnàmhadh iomlan a choileanadh. Air an dàrna latha, chaidh an sampall a chuir ann an centrifuge aig 20,000 g airson 20 mionaidean. Chaidh an supernatant a lagachadh le 0.1% searbhag formach, agus chaidh an fhuasgladh a dhì-shalannachadh le StageTips dèanta leis fhèin. Chaidh an sampall a thiormachadh ann an inneal SpeedVac (Eppendorf concentrator plus 5305) aig 45°C, agus an uairsin chaidh am peptide a chrochadh ann an 0.1% searbhag formach. Chaidh na sampallan uile ullachadh aig an aon àm leis an aon neach. Gus sampallan astrocyte a sgrùdadh, chaidh 4 μg de peptides dì-shaillte a chomharrachadh le taga mais tandem (TMT10plex, àireamh catalog 90110, Thermo Fisher Scientific) le co-mheas peptide gu reagent TMT de 1:20. Airson lipéadadh TMT, chaidh 0.8 mg de reagent TMT ath-chreachadh ann an 70 μl de ACN gun uisge, agus chaidh am peptide tioram ath-chruthachadh ann an 9 μl de 0.1 M TEAB (triethylammonium bicarbonate), ris an deach 7 μl de reagent TMT ann an ACN a chur ris. B’ e 43.75% an dùmhlachd. Às deidh 60 mionaid de ghoir, chaidh an ath-bhualadh a mhùchadh le 2 μl de 5% hydroxylamine. Chaidh na peptidean le bileagan a chruinneachadh, a thiormachadh, an ath-fhulang ann an 200μl de 0.1% searbhag formach (FA), an roinn ann an dhà, agus an uairsin an dì-shalannachadh le bhith a’ cleachdadh StageTips a chaidh a dhèanamh leotha fhèin. Le bhith a’ cleachdadh cromatagraf leaghaidh ultra àrd-choileanaidh UltiMate 3000 (cromatagraf leaghaidh ultra àrd-choileanaidh UltiMate 3000), chaidh aon den dà leth a roinn air colbh cromatagrafaidheachd Acquity 1mm x 150mm air a lìonadh le mìrean C18 130Å1.7μm (Waters, Àireamh catalog SKU: 186006935). Thermo Fisher Scientific). Sgar na peptidean aig ìre sruthadh de 30μl/min, sgar bho 1% gu 50% bufair B airson 85 mionaidean le caisead ceum air cheum de 96 mionaidean, bho 50% gu 95% bufair B airson 3 mionaidean, agus an uairsin 8 mionaidean airson 95% Bufair B; Tha bufair A 5% ACN agus 10 mM ammonium bicarbonate (ABC), agus tha bufair B 80% ACN agus 10 mM ABC. Cruinnich na bloighean gach 3 mionaidean agus cuir còmhla iad ann an dà bhuidheann (1 + 17, 2 + 18, msaa.) agus tiormaich iad ann an centrifuge falamh.
Mion-sgrùdadh LC-MS/MS. Airson speactramaitreachd mais, chaidh na peptidean (àireamh r119.aq) a sgaradh air colbh anailis PicoFrit 25 cm, 75 μm de thrast-thomhas a-staigh (lionsa amas ùr, àireamh pàirt PF7508250) uidheamaichte le meadhan ReproSil-Pur 120 C18-AQ 1.9 μm (Dr. Maisch, mat), Cleachd EASY-nLC 1200 (Thermo Fisher Scientific, a' Ghearmailt). Chaidh an colbh a chumail aig 50°C. Tha bufairean A agus B nan 0.1% searbhag formach ann an uisge agus 0.1% searbhag formach ann an 80% ACN, fa leth. Chaidh peptidean a sgaradh bho 6% gu 31% bufair B airson 65 mionaidean agus bho 31% gu 50% bufair B airson 5 mionaidean le caisead de 200 nl/min. Chaidh na peptidean a chaidh a leigeil ma sgaoil a sgrùdadh air speactramaitreachd mais Orbitrap Fusion (Thermo Fisher Scientific). Thèid tomhas m/z ro-ruithear peptide a dhèanamh le rùn de 120,000 anns an raon eadar 350 agus 1500 m/z. A’ cleachdadh 27% de lùth bualadh àbhaisteach, thèid an ro-ruithear as làidire le staid cosgais de 2 gu 6 a thaghadh airson sgoltadh le dealachadh ribe C àrd-lùtha (HCD). Thèid an ùine cearcall a shuidheachadh gu 1 s. Chaidh luach m/z a’ bhloigh peptide a thomhas anns an ribe ian a’ cleachdadh an targaid AGC as lugha de 5 × 104 agus an ùine stealladh as motha de 86 ms. Às dèidh a’ bhloigh, chaidh an ro-ruithear a chur air an liosta dùinte fiùghantach airson 45 s. Chaidh peptidean le bileagan TMT a sgaradh air colbh Acclaim PepMap 50 cm, 75 μm (Thermo Fisher Scientific, àireamh catalog 164942), agus chaidh na speactraman imrich a sgrùdadh air speactrometer mais Orbitrap Lumos Tribrid (Thermo Fisher Scientific) uidheamaichte le uidheamachd ianan tonn-chruth neo-chothromach raon àrd (FAIMS) (Thermo Fisher Scientific) ag obrachadh aig dà bholtaids dìolaidh de −50 agus −70 V. Tha MS3 a chaidh a thaghadh stèidhichte air an ro-ruithear sioncronaidh air a chleachdadh airson tomhas comharra ian aithisg TMT. Chaidh an sgaradh peptide a dhèanamh air EASY-nLC 1200, a’ cleachdadh elution caisead loidhneach 90%, le dùmhlachd bufair de 6% gu 31%; b’ e 0.1% FA bufair A, agus b’ e 0.1% FA agus 80% ACN bufair B. Tha an colbh anailiseach air obrachadh aig 50°C. Cleachd FreeStyle (dreach 1.6, Thermo Fisher Scientific) gus am faidhle tùsail a sgaradh a rèir bholtaids dìolaidh FAIMS.
Comharrachadh agus tomhas phròtainean. A’ cleachdadh einnsean sgrùdaidh Andromeda amalaichte, chaidh an dàta tùsail a sgrùdadh a’ cleachdadh MaxQuant dreach 1.5.2.8 (https://maxquant.org/). A bharrachd air na sreathan Cre recombinase agus YFP a fhuaireadh bho Aequorea victoria, chaidh speactraman earrannan peptide a sgrùdadh airson an t-sreath canònach agus an t-sreath isoform den proteome iomraidh luchaige (Proteome ID UP000000589, air a luchdachadh sìos bho UniProt sa Chèitean 2017). Chaidh oxidation methionine agus acetylation pròtain N-terminal a shuidheachadh mar atharrachaidhean caochlaideach; chaidh methylation cysteine ​​​​carbamoyl a shuidheachadh mar atharrachaidhean stèidhichte. Tha na paramadairean cnàmhaidh air an suidheachadh gu “sònrachas” agus “trypsin / P”. Is e 1 an àireamh as lugha de peptides agus peptides ràsair a thathas a’ cleachdadh airson comharrachadh pròtain; is e 0 an àireamh as lugha de peptides sònraichte. Fo chumhachan maidseadh mapa peptide, b’ e 0.01 an ìre comharrachadh pròtain. Tha an roghainn “Second Peptide” air a chomasachadh. Cleachd an roghainn “maids eadar ruith” gus dearbh-aithneachadh soirbheachail a ghluasad eadar faidhlichean tùsail eadar-dhealaichte. Cleachd cunntadh co-mheas as ìsle LFQ 1 airson tomhas gun leubail (LFQ) (60). Tha dian LFQ air a shìoladh airson co-dhiù dà luach dligheach ann an co-dhiù aon bhuidheann genotype aig gach puing ùine, agus tha e air a ro-mheasadh bho chuairteachadh àbhaisteach le leud de .0.3 agus gluais sìos 1.8. Cleachd àrd-ùrlar coimpiutaireachd Perseus (https://maxquant.net/perseus/) agus R (https://r-project.org/) gus toraidhean LFQ a sgrùdadh. Chaidh deuchainn t meadhanach dà-shligheach bhon phacaid bathar-bog limma a chleachdadh airson mion-sgrùdadh eadar-dhealachaidh abairtean (61). Tha mion-sgrùdadh dàta rannsachail air a dhèanamh a’ cleachdadh ggplot, FactoMineR, factoextra, GGally agus pheatmap. Chaidh an dàta proteomics stèidhichte air TMT a sgrùdadh a’ cleachdadh MaxQuant dreach 1.6.10.43. Lorg dàta pròtain-eòlais amh bho stòr-dàta pròtain-eòlais daonna UniProt, a chaidh a luchdachadh sìos san t-Sultain 2018. Tha am factar ceartachaidh purrachd isotope a thug an neach-dèanamh seachad air a ghabhail a-steach san anailis. Cleachd limma ann an R airson mion-sgrùdadh eadar-dhealachaidh abairtean. Tha an dàta tùsail, toraidhean rannsachaidh stòr-dàta, agus sruth-obrach agus toraidhean mion-sgrùdadh dàta uile air an stòradh ann an co-bhanntachd ProteomeXchange tron ​​stòr-dàta com-pàirtiche PRIDE leis an aithnichear seata dàta PXD019690.
Bidh notaichean gnìomhach a’ neartachadh an anailis. Chaidh an inneal Ingenuity Pathway Analysis (QIAGEN) a chleachdadh gus beairteas nan teirmean notaichean gnìomhach den t-seata dàta aig 8 seachdainean a dhearbhadh (Figear 1). Ann an ùine ghoirid, thathas a’ cleachdadh an liosta phròtain cainneachdail a fhuaireadh bho mhion-sgrùdadh dàta LC-MS/MS (speictreamachd mais tandem) leis na slatan-tomhais sìoltachain a leanas: Tha Mus musculus air a thaghadh mar an gnè agus an cùl-raon, agus tha an roinn a’ sealltainn gu bheil an luach P air atharrachadh le Benjamini airson beairteachadh 0.05 no nas ìsle air a mheas cudromach. Airson a’ ghraf seo, thathas a’ sealltainn na còig roinnean cus as àirde anns gach cruinneachadh stèidhichte air an luach P atharraichte. A’ cleachdadh deuchainn-t iomadach, a’ cleachdadh prògram àrdachadh loidhneach dà-ìre Benjamini, Krieger, agus Yekutieli (Q = 5%), thèid mion-sgrùdadh abairt pròtain cùrsa-ùine a dhèanamh air na tagraichean cudromach a chaidh an comharrachadh anns gach roinn, agus tha gach sreath air a sgrùdadh air leth. Chan eil feum air SD cunbhalach a ghabhail os làimh.
Gus coimeas a dhèanamh eadar toraidhean an sgrùdaidh seo agus stòran-dàta foillsichte agus diagram Venn a chruthachadh ann am Figear 1, chuir sinn còmhla an liosta phròtainean cainneachdail le notaichean MitoCarta 2.0 (24). Cleachd an inneal air-loidhne Draw Venn Diagram (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/) gus an diagram a chruthachadh.
Airson fiosrachadh mionaideach mu na modhan staitistigeil a thathar a’ cleachdadh airson mion-sgrùdadh proteomics, thoir sùil air an earrann co-fhreagarrach de Stuthan agus Modhan. Airson a h-uile deuchainn eile, gheibhear fiosrachadh mionaideach anns an uirsgeul co-fhreagarrach. Mura h-eilear ag ràdh a chaochladh, tha a h-uile dàta air a chur an cèill mar chuibheasachd ± SEM, agus chaidh a h-uile mion-sgrùdadh staitistigeil a dhèanamh a’ cleachdadh bathar-bog GraphPad Prism 8.1.2.
Airson stuthan a bharrachd airson an artaigil seo, faic http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/35/eaba8271/DC1
Is e seo artaigil fosgailte a tha air a sgaoileadh fo chumhachan Ceadachas Neo-Mhalairteach Attribution Creative Commons, a leigeas le cleachdadh, sgaoileadh agus ath-riochdachadh ann am meadhan sam bith, fhad ‘s nach eil an cleachdadh deireannach airson buannachd mhalairteach agus gur e am bun-bheachd gu bheil an obair thùsail ceart. Iomradh.
Nota: Chan eil sinn ag iarraidh ort ach do sheòladh puist-d a thoirt seachad gus am bi fios aig an neach a tha thu a’ moladh don duilleag gu bheil thu airson gum faic iad am post-d agus nach e spama a th’ ann. Cha ghlac sinn seòlaidhean puist-d sam bith.
Cleachdar a’ cheist seo gus dearbhadh a bheil thu nad neach-tadhail agus gus casg a chuir air spama fèin-ghluasadach.
Le E. Motori, I. Atanassov, SMV Kochan, K. Folz-Donahue, V. Sakthivelu, P. Giavalisco, N. Toni, J. Puyal, N.-G. Larson
Nochd mion-sgrùdadh proteomics air neurons mì-ghnìomhach gu bheil prògraman metabolach air an cur an gnìomh gus neurodegeneration a chasg.
Le E. Motori, I. Atanassov, SMV Kochan, K. Folz-Donahue, V. Sakthivelu, P. Giavalisco, N. Toni, J. Puyal, N.-G. Larson
Nochd mion-sgrùdadh proteomics air neurons mì-ghnìomhach gu bheil prògraman metabolach air an cur an gnìomh gus neurodegeneration a chasg.
©2020 Comann Ameireagaidh airson Adhartachadh Saidheans. gach còir glèidhte. Tha AAAS na chom-pàirtiche de HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef agus COUNTER. SaidheansAdvances ISSN 2375-2548.