Seòladh làithreach†Seòladh làithreach: OX11 0DE, RA, Togalach Diamond, Pàirc Saidheans is Nuadhachd Harwell, Dietcote, Oxfordshire, RA, Diamond Light Source Co., Ltd., Ionad Ìomhaighean Bith-eòlasach Dealanach.
’S e co-thàthadh buain-solais ionad ath-bhualaidh 1 (RC-LH1) am prìomh phàirt foto-cho-chur de bacteria purpaidh fototrofach. Thug sinn a-steach dà structar microscopaidh crio-electron den cho-thàthadh RC-LH1 bho Rhodopseudomonas palustris. Tha structar rùn 2.65-Å a’ cho-thàthaidh RC-LH114-W air a dhèanamh suas de 14 lùban fo-aonad LH1 a’ cuairteachadh RC, a tha air a bhriseadh le pròtain W, agus tha an co-thàthadh às aonais pròtain-W gu tur air a dhèanamh suas de RC air a chuairteachadh le RC. Lùb LH1 dùinte le 16 fo-aonad. Tha an coimeas eadar na structaran sin a’ toirt sealladh air daineamaigs quinone anns a’ cho-thàthadh RC-LH1, a’ gabhail a-steach atharrachaidhean co-dhealbhach nach robh air an dearbhadh roimhe nuair a bhios quinone a’ ceangal ri làrach RC QB, a bharrachd air suidheachadh làraichean ceangail quinone taiceil, a chuidicheas le bhith gan toirt gu RC. Tha structar sònraichte a’ phròtain W a’ cur casg air dùnadh lùb LH1, agus mar sin a’ cruthachadh seanail airson an iomlaid quinone/quinolone a luathachadh.
Faodaidh an lùth a bheirear seachad le foto-co-chur cha mhòr a h-uile beatha air an talamh a chumail suas, agus tha comas mòr aige airson bith-theicneòlas na grèine. Ged a tha iad a’ brosnachadh foto-co-chur cruinneil, bidh bacteria purpaidh foto-thròfach cuideachd a’ nochdadh diofar mhodhan lùtha agus comasan metabolach. Faodaidh iad foto-co-chur a sheachnadh agus fàs mar bacteria hetero-thròfach anns an dorchadas, faodaidh iad naitridean agus carbon dà-ogsaid a shocrachadh, haidridean a thoirt gu buil, agus todhar cùbhraidh a bhriseadh sìos (1-3). Gus lùth a thoirt seachad airson nam pròiseasan sin, feumar solas a thionndadh gu lùth ceimigeach gu sgiobalta agus gu h-èifeachdach. Bidh am pròiseas seo a’ tòiseachadh nuair a bhios an co-thàthadh antenna glacaidh-solais a’ gabhail a-steach solas agus a’ gluasad an lùth glacte chun ionad ath-bhualadh (RC), agus mar sin a’ tòiseachadh air dealachadh luchdan (4-7). Tha am bun-aonad de foto-co-chur ann am bacteria purpaidh foto-thròfach air a dhèanamh suas de RC seòrsa 2, air a chuairteachadh le co-thàthadh buain-solais 1 (LH1), a’ cruthachadh a’ cho-thàthaidh chridhe RC-LH1. Tha LH1 air a chruthachadh le sreath de heterodimers αβ lùbte, agus gach fear dhiubh a’ ceangal dà mholacilean clorophyll bacterial (BChl) a agus aon no dhà carotenoid (8-12). Tha an antenna LH1 as sìmplidh air a dhèanamh suas de 16 no 17 heterodimers αβ a’ cuairteachadh RC (9-13) ann an lùb dùinte, ach ann an co-thàthaidhean cridhe eile, bidh peptides thar-membran a’ cur bacadh air leantainneachd an LH1 mun cuairt, agus mar sin a’ brosnachadh sgaoileadh quinol/quinone eadar RC agus co-thàthadh cytochrome bc1 (11, 13-15). Tha an lus phototrophic purpaidh Rhodopseudomonas (Rps.) na fhàs-bheairt modail as urrainn tuigse fhaighinn air an gluasad lùtha is dealan a tha a’ toirt taic do foto-cho-chur. A’ chiad structar criostail de Rps. Is e RC modail a’ cho-thàthaidh palustris RC-LH1, air a chuairteachadh le 15 lùban heterodimeric LH1, a tha air am briseadh le pròtain neo-aithnichte ris an canar “Protein W” (14). Chaidh Protein-W a chomharrachadh às deidh sin mar RPA4402, a tha na phròtain 10.5kDa gun chomharradh le trì helices thar-membran ro-innseach (TMH) (16). Tha sinn a’ moladh ainm a thoirt air a’ ghine rpa4402 a tha a’ còdachadh pròtain W gu pufW gus a bhith a rèir an ainmeachaidh a thathar a’ cleachdadh airson ginean a tha a’ còdachadh fo-aonadan RC-L, M (pufL, pufM) agus LH1α, β (pufA, pufB). Gu inntinneach, chan eil pròtain-W an làthair ach ann an timcheall air 10% de RC-LH1, a’ nochdadh gu bheil Rps. palustris a’ dèanamh dà cho-thàthadh RC-LH1 eadar-dhealaichte. An seo, tha sinn ag aithris air structaran crio-EM àrd-rèiteachaidh (cryo-EM) dà cho-thàthadh bunaiteach, aon le pròtain W agus 14 αβ heterodimers, am fear eile às aonais pròtain W agus lùb LH1 Heterodimer dùinte 16. Tha an structar againn a’ riochdachadh atharrachadh mòr ann an tuigse air co-thàthadh RC-LH1 de Rps. palustris, leis gu bheil sinn air sluagh aon-ghnèitheach gach caochlaideach a sgrùdadh agus gu bheil rùn gu leòr againn gus gach peptide agus pigmentan ceangailte agus lipids agus quinones co-cheangailte a shònrachadh gu soilleir. Tha an coimeas eadar na structaran seo a’ sealltainn gu bheil na trì pròtainean TMH-W nach deach a lorg ann an co-thàth RC-LH1 sam bith eile gu ruige seo a’ gineadh seanail quinone gus iomlaid quinone/quinolone a luathachadh. Chaidh grunn làraichean ceangail lipid is quinone glèidhte a chomharrachadh, agus tha sinn air atharrachadh cumadh ùr fhoillseachadh às dèidh measgachadh quinone agus RC, a dh’ fhaodadh a bhith freagarrach airson RC photosystem II (PSII) de fhàs-bheairtean fototrofach ocsaideanaichte. Tha na co-dhùnaidhean againn a’ toirt sealladh ùr air cineatachd ceangail is iomlaid quinone/quinolone ann an co-thàth cridhe RC-LH1 de bacteria fototrofach purpaidh.
Gus sgrùdadh mionaideach a dhèanamh nas fhasa air an dà cho-thàthadh a lorgar ann an Rps. palustris, bidh sinn a’ sgaradh gach RC-LH1 le dòighean bith-cheimiceach. Chaidh an co-thàthadh easbhaidheach pròtain W (ris an canar ΔpufW an-seo) a ghlanadh bhon t-sreath aig nach eil am gine pufW (16), agus chan urrainnear ach aon cho-thàthadh RC-LH1 a thoirt gu buil. Tha an co-thàthadh anns a bheil pròtain W air a thoirt gu buil le sreath. Tha pròtain W a’ ghnè seo air atharrachadh le taga 10x His aig a cheann-C, gus an gabh an co-thàthadh anns a bheil pròtain W a chur còmhla gu h-èifeachdach leis a’ mhòr-chuid de phròtain W aig nach eil e le bhith a’ cur meatailt gun ghluasad. Tha an co-thàthadh air a sgaradh gu h-èifeachdach (16) Affinity Chromatography (IMAC).
Mar a chithear ann am Figear 1, tha trì fo-aonadan RC (RC-L, RC-M agus RC-H) anns an dà cho-thàthadh air a chuairteachadh le antenna LH1. Tha structar 2.80-A a’ cho-thàthaidh às aonais pròtain-W a’ sealltainn 16 αβ heterodimers, a’ cruthachadh lùb LH1 dùinte a tha gu tur a’ cuairteachadh RC, ris an canar an co-thàthadh RC-LH116 an-seo. Tha 14-heterodimer LH1 aig structar 2.65Å a’ cho-thàthaidh anns a bheil pròtain-W air a bhriseadh le pròtain-W, ris an canar RC-LH114-W an-seo.
(A agus B) Riochdachadh uachdar a’ cho-thàthaidh. (C agus D) Pigmentan ceangailte air an cur an cèill ann an slataichean. (E agus F) Tha na peptidean agus na fo-aonadan LH1 air an riochdachadh ann an cartùnaichean aig na co-thàthaidhean a chithear bhon uachdar siotoplasmach, agus tha iad air an àireamhachadh deiseal bhon bheàrn pròtain-W [a rèir àireamhachadh Rba. co-thàthadh sphaeroides (13)]. Airson LH1-α, tha dath an fho-aonad pròtain buidhe; airson LH1-β, tha dath an fho-aonad pròtain gorm; airson pròtain-W, tha am pròtain dearg; airson RC-H, tha e cyan; airson RC-L, tha e orains; airson RC-M, magenta. Tha co-fhactaran air an riochdachadh le slataichean, tha uaine a’ riochdachadh moileciuilean BChl agus BPh a, tha purpaidh a’ riochdachadh carotenoids, agus tha buidhe a’ riochdachadh moileciuilean UQ10. (G agus H) Sealladh meudaichte den bheàrn pròtain-W anns an roinn cho-ionann de cho-thàthadh RC-LH114-W (G) agus co-thàthadh RC-LH116 (H). Tha co-fhactaran air an taisbeanadh ann an cruth lìonadh beàrn, tha quinone chelated air a thaisbeanadh ann an gorm. Tha am beàrn pròtain-W air a chomharrachadh le loidhne phrìosanach ghorm ann an (G), agus tha na tuill bheaga far a bheil quinone/quinolol a’ sgaoileadh air an fhàinne LH116 air an comharrachadh le loidhne phrìosanach dhubh ann an (H).
Tha Figear 1 (A agus B) a’ sealltainn an RC air a chuairteachadh le sreathan fosgailte no dùinte de heterodimers LH1αβ, agus gach fear dhiubh a’ ceangal dà BChl agus aon carotenoid (Figear 1, C agus D). Tha sgrùdaidhean roimhe air sealltainn gur e Rps an co-thàthadh LH1. Anns an t-slighe bith-cho-chur de spirulina xanthin, tha measgachadh de charotenoids anns na gnèithean seo (17). Ach, is e spiropyrroxanthin an carotenoid as làidire agus tha an dùmhlachd aige riarachail. Mar sin, roghnaich sinn modaladh spiroxanthin aig a h-uile làrach ceangail LH1. Tha na polypeptides alpha agus beta nan TMHan singilte le roinnean goirid a-muigh den membran (Figear 1, A, B, E, agus F). Ged nach deach dùmhlachd 17 fuigheall aig an C-terminus fhaicinn, chaidh am polypeptide alpha a sgoltadh bho Met1 gu Ala46 anns an dà cho-thàthadh. Chaidh polypeptide β a lùghdachadh bho Gly4 gu Tyr52 ann an RC-LH116, agus bho Ser5 gu Tyr52 ann an RC-LH114-W. Cha deach dùmhlachd de 3 no 4 fuigheall N-terminal no 13 C-terminal fhaicinn (Figear S1). Sheall mion-sgrùdadh mais-speictreamachd den cho-thàthadh RC-LH1 measgaichte a chaidh ullachadh bhon t-seòrsa fiadhaich gur e toradh sgoltadh heterologach nan peptidean sin a bh’ anns an roinn a bha a dhìth (Figear S1 agus S2). Chaidh cruthachadh N-terminal de α-Met1 fhaicinn cuideachd (f). Sheall an sgrùdadh gu bheil an α-peptide air a dhèanamh suas de fhuigheallan fMet1 gu Asp42/Ala46/Ala47/Ala50, agus gu bheil am β-peptide air a dhèanamh suas de fhuigheallan Ser2 gu Ala53, a tha ann an deagh cho-chòrdadh ris a’ mhapa dùmhlachd EM aig teòthachd ìosal.
Bidh co-òrdanachadh α-His29 agus β-His36 a’ dèanamh BChls aghaidh ri aghaidh; bidh gach heterodimer αβ a’ cruinneachadh leis na nàbaidhean aige gus lùb fosgailte (RC-LH114-W) no lùb dùinte (RC-LH116) a chruthachadh timcheall air an RC. An sreath pigment ceangailte ri exciton (Figear 1, C agus D). An coimeas ris a’ chòmhlan 877 nm de RC-LH114-W, tha an gluasad dearg gabhail 880 nm de RC-LH116 3 nm (Figear 2A). Ach, tha an speactram dà-chroiseachd cruinn cha mhòr an aon rud (Figear 2B), a’ nochdadh ged a tha eadar-dhealachadh soilleir eadar lùban fosgailte agus dùinte, gu bheil an àrainneachd ionadail aig BChls glè choltach. Dh’ fhaodadh an gluasad dearg gabhail a bhith mar thoradh air gluasad teirmeach nas lugha agus seasmhachd nas motha air an lùb dùinte (18, 19), an t-atharrachadh ann an ceangal pigment air adhbhrachadh leis an lùb dùinte (20, 21), no measgachadh den dà bhuaidh seo (11).
(A) Speactram gabhail ultraviolet/faicsinneach/faisg air infridhearg, agus na mullaichean aige air an comharrachadh leis na pigmentan co-fhreagarrach aca agus air an gnàthachadh gu mullach BPh aig 775 nm. (B) Speactram dà-chroiseachd cruinn air a ghnìomhadh gu gabhail BChl aig 805 nm. (C agus D) Speactraman ΔA taghte bho na speactra gabhail rùinte-ùine de cho-thàthadh RC-LH114-W (C) agus co-thàthadh RC-LH116 (D). Airson coimeasachd nas fheàrr, tha na speactraman uile air an gnàthachadh gu ∆A de −A aig 0.2 ps. (E) An ìre ocsaididh cytochrome c2 às dèidh rèididheachd an làthair diofar cho-chruinneachaidhean de UQ2 (faic Figear S8 airson dàta amh). (F) Ann an ceallan air an fàs fo sholas ìosal, meadhanach no àrd dian (10, 30 no 300μMm-2 s-1, fa leth), na fo-aonadan pròtain W agus RC-L anns a’ cho-thàthadh glan agus an co-mheas membran air a sgaradh. Obraich a-mach an ìre pròtain le electrophoresis gel SDS-polyacrylamide agus immunoassay (faic Figear S9 airson dàta amh). Obraich a-mach an co-mheas an coimeas ris a’ cho-thàthadh RC-LH114-W glan. Is e 1:1 an co-mheas stoichiometric de RC-L ri pròtain-W den cho-thàthadh.
Tha na BChlan aig suidheachadh 1 anns an lùb αβ14 deformaichte de RC-LH114-W (Figear 1, A, C, agus E) nas fhaisge air an tabhartaiche bun-sgoile RC (P) le 6.8 Å na na BChlan co-ionann ann an RC-LH116 (Figear 1, B, D, agus F, agus Figear S3); ge-tà, tha cineatics gabhail sealach an dà cho-thàthadh a’ sealltainn, airson RC-LH114-W agus RC-LH116, gu bheil na cunbhalachdan ùine gluasaid lùth brosnachaidh bho LH1 gu RC 40 ±4 agus 44 ± 3 ps (Figear 2). , C agus D, Figear S4 agus Clàr S2). Chan eil eadar-dhealachadh mòr ann an gluasad dealanach taobh a-staigh RC (Figear S5 agus teacsa co-cheangailte). Tha sinn an amharas gu bheil an co-fhreagarrachd dlùth eadar an ùine gluasaid lùtha eadar LH1 agus RC-P mar thoradh air an astar, an ceàrn agus an lùth comasach coltach ris a’ mhòr-chuid de BChl anns an dà lùb LH1. Tha e coltach nach eil sgrùdadh pàtran lùtha LH1 gus an astar as lugha a ruighinn nas luaithe na gluasad lùtha dìreach bho làraichean fo-iomchaidh gu RC. Dh’ fhaodadh gum bi gluasad teirmeach neo-shuntasach aig lùb fosgailte LH1 ann an RC-LH114-W fo chumhachan teòthachd ìosal airson mion-sgrùdadh structarail, agus tha cumadh fàinne αβ14 nas fhaide aig teòthachd an t-seòmair bhon astar dathachaidh de βBChls aig suidheachadh RC 1.
Tha 32 BChl agus 16 carotenoid anns a’ cho-thàth RC-LH116, agus tha an rèiteachadh iomlan aige mar an ceudna ris an fhear a fhuaireadh bho Thermochromatium (Tch.) pidpidum [Protein Data Bank (PDB) ID 5Y5S] (9), Thiorhodovibrio (Trv.) 970 strain (PDB ID 7C9R) (12) agus algaich uaine (Blc.viridis) (PDB ID 6ET5) (10). Às dèidh co-thaobhadh, cha deach ach beagan atharrachaidhean fhaicinn ann an suidheachaidhean heterodimers αβ, gu sònraichte 1-5, 15, agus 16 (Figear S6). Tha buaidh mhòr aig làthaireachd pròtain-W air structar LH1. Tha na trì TMH aige ceangailte le lùban goirid, leis an N-terminal air taobh lumen a’ cho-thàthaidh agus an C-terminal air an taobh cytoplasmic (Figearan 1A agus 3, A gu D). Tha Pròtain-W gu ìre mhòr hydrophobic (Figear 3B), agus bidh TMH2 agus TMH3 ag eadar-obrachadh le LH1αβ-14 gus uachdar thar-membran a chruthachadh (Figear 3, B agus E gu G). Tha an eadar-aghaidh air a dhèanamh suas sa mhòr-chuid de fhuigheallan Phe, Leu agus Val anns an roinn thar-membran. Tha na fuigheallan seo air an cruachadh le amino-aigéid hydrophobic agus pigmentan αβ-14. Bidh cuid de fhuigheallan pòlar cuideachd a’ cur ris an eadar-obrachadh, a’ gabhail a-steach a’ cheangal haidridean eadar W-Thr68 agus β-Trp42 air uachdar na cuasa iom-fhillte (Figear 3, F agus G). Air uachdar an cytoplasm, tha Gln34 ri taobh a’ bhuidheann keto de carotenoids αβ-14. A bharrachd air an sin, chaidh am moileciuil n-dodecyl β-d-maltoside (β-DDM) a rèiteachadh, agus leudaich an earball hydrophobic aige chun an eadar-aghaidh eadar pròtain-W agus αβ-14, agus is dòcha gu bheil an earball lipid suidhichte sa bhodhaig. Mhothaich sinn cuideachd gu bheil roinnean fuasglaidh C-criochnach pròtain W agus RCH glè fhaisg air a chèile, ach chan eil iad taobh a-staigh raon eadar-obrachaidhean sònraichte a chruthachadh (Figear 1, A agus E). Ach, dh’ fhaodadh gum bi eadar-obrachaidhean ann an amino-aigéid neo-fhuasglaichte C-criochnach an dà phròtain seo, a dh’ fhaodadh dòigh a thoirt seachad airson pròtain-W a thàladh nuair a thathar a’ cruinneachadh an iom-fhillte RC-LH114-W.
(A) Tha slabhraidh taobh slat-chruthach (dearg) aig Pròtain-W, a tha mu choinneamh an eadar-aghaidh le LH1αβ14 ann an cruth cartùn, air a thaisbeanadh ann am pàirt den diagram comas electrostatach (uachdar liath follaiseach le ìre cumadh de 0.13). (B) Pròtain-W air a riochdachadh le uachdar dathte hydrophobic. Tha raointean pòlar agus luchdaichte air an taisbeanadh ann an cyan, tha raointean hydrophobic air an taisbeanadh ann an geal, agus tha raointean làidir hydrophobic air an taisbeanadh ann an orains. (C agus D) Pròtain-W air a riochdachadh ann an cartùn, tha an treòrachadh aige mar an ceudna ri (A) (C), agus air a thionndadh 180° (D). A rèir an t-suidheachaidh san t-sreath, bidh na fuigheallan eadar-dhealaichte a’ gabhail ri sgeama dathan bogha-froise, far a bheil an N-terminal gorm agus an C-terminal dearg. (E) Pròtain-W san aon sealladh ri (A), agus tha na fuigheallan aig eadar-aghaidh pròtain-W:LH1 air an riochdachadh le slataichean le comharran ceangailte. (F) Tha Protein-W air a thionndadh 90° an coimeas ri (E) agus LH1αβ14 anns an riochdachadh cartùn, agus an coimeas ris na fuigheallan eadar-aghaidh anns an riochdachadh bàr. Tha na fuigheallan a tha crochte bhon polypeptide beta air an comharrachadh. Tha an cofactor air a shealltainn mar bhàr a tha a’ freagairt ri dath Figear 1, tha am β-DDM lobhadh air a shealltainn ann an liath, agus tha an ocsaidean air a shealltainn ann an dearg. (G) Tha an sealladh ann an (F) air a thionndadh 180°, leis na fuigheallan follaiseach den polypeptide alpha air a chomharrachadh.
Tha Protein-W a’ cur àite heterodimer αβ (an 15mh ann am Figear 1F), agus mar sin a’ cur casg air dùnadh lùb agus a’ claonadh a’ chiad trì heterodimers αβ. Chaidh fhaicinn gur e 25° gu 29° (Figear 1, A agus E) an ceàrn claonaidh as àirde den chiad heterodimer αβ-1 an coimeas ris an àbhaist film, a chaidh a chruthachadh leis a’ chlaonadh 2° gu 8° de αβ-1 ann an RC A sharp contrast-LH116 (Figear 1, B agus F). Tha an dàrna agus an treas heterodimer claon aig 12° gu 22° agus 5° gu 10°, fa leth. Air sgàth bacadh steireach RC, chan eil claonadh αβ-1 a’ toirt a-steach an dàrna paidhir de αβ (a tha a’ freagairt ris an 16mh αβ ann am Figear 1F), agus mar sin a’ cruthachadh beàrn soilleir ann am fàinne LH1 (Figear 1, A agus E). Air sgàth dìth dà heterodimer αβ, còmhla ri call ceithir BChl agus dà carotenoid, chan eil gin de na carotenoid a’ ceangal ris an fho-aonad αβ-1 toinnte, agus mar thoradh air sin tha fàinne LH114-W ann anns a bheil 13 carotenoid Vegetarian agus 28 BChl. Tha na tuairmsean rùn ionadail airson an dà cho-thàthadh anns na roinnean αβ1 gu 7 nas ìsle na an fheadhainn airson a’ chòrr den lùb LH1, agus dh’ fhaodadh seo a bhith a’ nochdadh plasticity nàdarrach an fho-aonaid LH1 ri taobh làrach RC QB (Figear 4).
Tha na dealbhan de RC-LH114-W (A agus B) agus RC-LH116 (C agus D) air an sealltainn bhon aon shealladh àrd/taobh (A agus B) (A agus C) agus uachdar na cuasa ann am Figear 1. (B agus D). Tha na h-iuchraichean dathte air an sealltainn air an taobh cheart.
Is e an aon cho-thàthadh cridhe sònraichte eile le co-mheas stoichiometric de 1:14 an dimer Rhodococcus sphaeroides (Rba.) RC-LH1-PufX (13). Ach, chan eil co-chosmhaileachd follaiseach aig pròtain W agus PufX, agus tha buaidh mhòr aca air na structaran LH1 fa leth aca. Tha PufX na TMH singilte le raon siotoplasmach N-terminal a bhios ag eadar-obrachadh leis an taobh siotoplasmach den fho-aonad RC-H (13) aig suidheachadh a tha a’ freagairt ri Rps. palustris LH116αβ-16. Bidh PufX a’ cruthachadh seanail airson an iomlaid quinone/quinolone eadar RC-LH1 agus an co-thàthadh cytochrome bcl agus tha e an làthair anns a h-uile co-thàthadh cridhe Rba. sphaeroides (13). Ged a tha an eadar-aghaidh monomer-monomer ann an Rba. Tha an dimer sphaeroides RC-LH1-PufX suidhichte aig suidheachadh ceangail pròtain W ann an RC-LH114-W, agus tha am beàrn air a bhrosnachadh le PufX agus pròtain-W aig suidheachadh co-ionann (Figear S7A). Tha am beàrn ann an RC-LH114-W cuideachd air a cho-thaobhadh ris an t-sianal quinone hipiteigeach (8) de Pseudomonas rosea LH1, a tha air a chruthachadh le peptides nach eil co-cheangailte ri pròtain W no PufX (Figear S7B). A bharrachd air an sin, tha an sianal quinone ann am Blc. Tha an LH1 uaine emerald a chaidh a chruthachadh le bhith a’ dùnadh a-mach aon fho-aonad γ (7) suidhichte ann an suidheachadh coltach ris (Figear S7C). Ged a tha e air a mheadhanachadh le diofar phròtainean, tha coltas nan seanalan quinone/quinolol seo ann an suidheachadh cumanta anns an iom-fhillte RC-LH1 coltach ri eisimpleir de mean-fhàs co-chruinneachaidh, a’ nochdadh gum faodadh am beàrn a chruthaich pròtain W a bhith na sheanal quinone.
Tha am beàrn anns an lùb LH114-W a’ leigeil le cruthachadh roinn leantainneach den membran eadar an àite a-staigh den cho-thàthadh RC-LH114-W agus am membran mòr (Figear 1G), seach a bhith a’ ceangal an dà raon tro phòr pròtain mar a tha ann am pròtainean. Tha an co-thàthadh RC-LH116 coltach ri co-thàthadh Tch. dùinte coltach ri snàthad (22) (Figear 1H). Leis gu bheil sgaoileadh quinone tron ​​membran nas luaithe na an sgaoileadh tron ​​t-sianal pròtain cumhang, faodaidh an lùb LH114-W fosgailte leigeil le tionndadh RC nas luaithe na an lùb LH116 dùinte, agus is dòcha gu bheil sgaoileadh quinone a-steach don RC nas cuingealaichte. Gus deuchainn a dhèanamh a bheil buaidh aig pròtain W air tionndadh quinones tro RC, rinn sinn deuchainn oxidation cytochrome air dùmhlachd sònraichte de ubiquinone 2 (UQ2) (analog de UQ10 nàdarra le earball isoprene nas giorra) (Figear 2E). Ged a tha làthaireachd quinone chelated a’ cur bacadh air dearbhadh ceart air cunbhalachd follaiseach Michaelis (tha RC-LH114-W agus RC-LH116 freagarrach airson 0.2 ± 0.1 μM agus 0.5 ± 0.2 μM, fa leth), tha an ìre as àirde de RC-LH114-W (4.6 ± 0.2 e-RC-1 s-1) 28 ± 5% nas motha na RC-LH116 (3.6 ± 0.1 e-RC-1 s-1).
An toiseach, mheas sinn gu bheil pròtain-W an làthair ann an timcheall air 10% den cho-thàthadh cridhe (16); an seo, tha ìrean còmhnaidh cheallan fàis ìosal-sholais, meadhanach-sholais, agus àrd-sholais 15±0.6%, 11±1% agus 0.9±0.5, fa leth % (Figear 2F). Sheall coimeas cainneachdail de speactramaitreachd mais nach do lughdaich cur-ris taga histidine pailteas coimeasach pròtain-W an taca ri sreathan fiadhaich (P = 0.59), agus mar sin chan eil na h-ìrean sin nan artaifeact de phròtain-W atharraichte (Figear S10). Ach, is dòcha gun leig an còmhnaidh ìosal seo de phròtain-W anns a’ cho-thàthadh RC-LH1 le cuid de RCn tionndadh aig ìre luathaichte, agus mar sin a’ lughdachadh iomlaid quinone/quinolone nas slaodaiche anns a’ cho-thàthadh RC-LH116. Mhothaich sinn nach eil an ìre còmhnaidh solais àrd a rèir an dàta transcriptomics o chionn ghoirid, a tha a’ nochdadh gu bheil abairt gine pufW ag àrdachadh fo sholas làidir (Figear S11) (23). Tha an diofar eadar tar-sgrìobhadh pufW agus toirt a-steach pròtain-W a-steach don cho-thàth RC-LH1 troimh-chèile agus is dòcha gu bheil e a’ nochdadh riaghladh iom-fhillte a’ phròtain.
Ann an RC-LH114-W, tha 6 moileciuilean cardiolipin (CDL), 7 phosphatidylcholine (POPC), 1 phosphatidylglycerol (POPG) agus 29 moileciuilean β-DDM air an riarachadh agus air am modaladh ann an 6 CDLn, 24 POPCn, 2 POPGn agus 12 βDDMn. RC-LH116 (Figear 5, A agus B). Anns an dà structar seo, tha CDL cha mhòr suidhichte air taobh siotoplasmach a’ cho-thàthaidh, agus tha POPC, POPG agus β-DDM suidhichte sa mhòr-chuid air an taobh luminal. Chaidh dà moileciuil lipid agus inneal-glanaidh a sgaradh ann an roinn αβ-1 gu αβ-6 den cho-thàthadh RC-LH114-W (Figear 5A), agus chaidh còignear a sgaradh anns an roinn cho-ionann de RC-LH116 (Figear 5B). Lorgar barrachd lipidean air an taobh eile den cho-thàthadh, gu h-àraidh CDL, air cruinneachadh eadar RC agus αβ-7 gu αβ-13 (Figear 5, A agus B). Tha lipidean agus innealan-glanaidh eile le rèiteachadh structarail suidhichte taobh a-muigh fàinne LH1, agus tha slabhraidhean acyl le rèiteachadh math a’ leudachadh eadar fo-aonadan LH1, air an ainmeachadh gu sealach mar β-DDM ann an RC-LH114-W, agus air am mìneachadh mar β-DDM ann an RC Measgachadh de β-DDM agus POPC-LH116. Tha na suidheachaidhean coltach ri chèile de lipidean agus innealan-glanaidh chelating san structar againn a’ nochdadh gu bheil iad nan làraichean ceangail buntainneach gu fiseòlasach (Figear S12A). Tha cunbhalachd mhath aig suidheachaidhean mholacilean co-ionann ann an Tch cuideachd. Gentle agus Trv. Sheall sreath 970 RC-LH1s (Figear S12, B gu E) (9, 12) agus na fuigheallan ceangail haidridean den bhuidheann cinn lipid glèidhteachas gu math math ann an co-thaobhadh an t-sreath (Figear S13), a’ nochdadh gu bheil CDL glèidhte a cheanglas ri RC (24), is dòcha gu bheil na làraichean sin air an glèidheadh ​​anns a’ cho-thàth RC-LH1.
(A agus B) Tha peptidean RC-LH114-W (A) agus RC-LH116 (B) air an riochdachadh le cartùnaichean, agus tha na pigmentan air an riochdachadh le slataichean, a’ cleachdadh an sgeama dathan ann am Figear 1. Tha lipidean air an sealltainn ann an dearg, agus tha innealan-glanaidh air an sealltainn ann an liath. Tha UQ ceangailte ri làraichean RC QA agus QB buidhe, agus tha UQ aonaranach gorm. (C agus D) Na h-aon sheallaidhean ri (A) agus (B), le lipidean air an leigeil seachad. (E gu G) Sealladh leudaichte de Q1(E), Q2(F) agus Q3(G) bho RC-LH116, le slabhraidhean taobh a bheir buaidh air a chèile. Tha na ceanglaichean haidridean air an sealltainn mar loidhnichean dubha briste.
Ann an RC-LH116, tha an dà chuid RC QA agus QB UQ, a bhios an sàs ann an gluasad electron sa phròiseas dealachaidh luchdan, air an lobhadh nan làraichean ceangail. Ach, ann an RC-LH114-W, chan eil QB quinone air a rèiteachadh agus thèid a dheasbad gu mionaideach gu h-ìosal. A bharrachd air QA agus QB quinones, tha dà mholacilean UQ chelated (suidhichte eadar na fàinneachan RC agus LH1) air an riarachadh ann an structar RC-LH114-W a rèir am buidhnean cinn a tha air an rèiteachadh gu math (suidhichte ann an Q1 agus Q2, fa leth). àite). Figear 5C). Tha dà aonad isoprene air an sònrachadh do Q1, agus tha am mapa dùmhlachd a’ rèiteachadh nan 10 earbaill isoprene iomlan de Q2. Ann an structar RC-LH116, chaidh trì mholacilean UQ10 chelated (Q1 gu Q3, Figear 5D) a rèiteachadh, agus tha dùmhlachd shoilleir aig a h-uile moileacilean air feadh an earbaill (Figear 5, D gu G). Anns an dà structar, tha cunbhalachd sàr-mhath aig suidheachaidhean nam buidhnean cinn quinone aig Q1 agus Q2 (Figear S12F), agus chan eil iad ag eadar-obrachadh ach le RC. Tha Q1 suidhichte aig beul beàrn W RC-LH114-W (Figear 1G agus 5, C, D agus E), agus tha Q2 suidhichte faisg air làrach ceangail QB (Figear 5, C, D) agus F). Tha na fuigheallan glèidhte L-Trp143 agus L-Trp269 glè fhaisg air Q1 agus Q2 agus a’ toirt seachad eadar-obrachaidhean cruachadh π a dh’fhaodadh a bhith ann (Figear 5, E agus F, agus Figear S12). Tha L-Gln88, 3.0 Å bhon ocsaidean distal aig Q1, a’ toirt seachad ceangal làidir haidridean (Figear 5E); tha an fuigheall seo glèidhte anns a h-uile RC ach a-mhàin an dàimh as fhaide air falbh (Figear S13). Tha L-Ser91 air a chur an àite Thr gu glèidhteach anns a’ mhòr-chuid de RCan eile (Figear S13), tha e 3.8 Angstroms bhon methyl ocsaidean ann an Q1, agus faodaidh e bannan haidridean lag a thoirt seachad (Figear 5E). Chan eil coltas gu bheil eadar-obrachadh sònraichte aig Q3, ach tha e suidhichte anns an roinn hydrophobic eadar an fho-aonad RC-M agus an fho-aonad LH1-α 5 gu 6 (Figear 5, D agus G). Chaidh Q1, Q2 agus Q3 no quinones chelated faisg air làimh a rèiteachadh cuideachd ann an Tch. Gentle, Trv. Strain 970 agus Blc. Tha structar an iris (9, 10, 12) a’ comharrachadh làrach ceangail quinone cuideachail glèidhte anns an iom-fhillte RC-LH1 (Figear S12G). Tha na còig UQan lobhadh ann an RC-LH116 ann an deagh cho-chòrdadh ris an 5.8 ± 0.7 de gach co-thàth a chaidh a dhearbhadh le cromagrafaidheachd leaghaidh àrd-choileanaidh (HPLC), agus tha na trì UQan lobhadh ann an RC-LH114-W nas ìsle na. Tha an luach tomhaiste de 6.2 ± 0.3 (Figear S14) a’ nochdadh gu bheil moileciuilean UQ gun fhuasgladh anns an structar.
Tha còig TMH anns gach aon de na polypeptides L agus M pseudo-chothromach agus cruthaichidh iad heterodimer a tha a’ cothlamadh aon dimer BChl, dà monomer BChl, dà monomer bacteriophage (BPh), agus aon iarann ​​neo-Heme agus aon no dhà mholaciul UQ10. Tro làthaireachd cheanglaichean haidridean air a’ bhuidheann ketone crìochnachaidh agus an cruinneachadh aithnichte ann an Rps, tha carotenoids air an toirt a-steach don fho-aonad M, ris an canar cis-3,4-dehydroorhodopin. Gnèithean (25). Tha fearann ​​​​membran a-muigh RC-H ceangailte ris a’ membran le aon TMH. Tha structar iomlan an RC coltach ris an trì fo-aonad RC de ghnèithean co-cheangailte (leithid Rba). sphaeroides (PDB ID: 3I4D). Tha macrocycles BChl agus BPh, cnàimh-droma carotenoid agus iarann ​​​​neo-heme a’ dol thairis air raon rùn nan structaran sin, mar a tha buidheann ceann UQ10 aig an làrach QA agus an QB quinone aig RC-LH116 (Figear S15).
Tha cothrom ùr ann a bhith a’ sgrùdadh nan atharrachaidhean cunbhalach ann an cumadh a tha an cois ceangal quinone QB. Anns a’ cho-thàthadh RC-LH116, tha quinone QB suidhichte san t-suidheachadh “proximal” làn-cheangailte (26), ach chan eil quinone QB aig dealachadh RC-LH114-W. Chan eil quinone QB ann an RC-LH114-W, rud a tha na iongnadh leis gu bheil an co-thàthadh gnìomhach, nas motha na an co-thàthadh RC-LH116 le quinone QB air a rèiteachadh gu structarail. Ged a bhios an dà fhàinne LH1 a’ chealachadh mu shia quinones, tha còig air an rèiteachadh gu structarail anns an fhàinne dùinte RC-LH116, agus chan eil ach trì air an cuingealachadh gu structarail anns an fhàinne fosgailte RC-LH114-W. Is dòcha gu bheil an eas-òrdugh structarail nas motha seo a’ nochdadh ath-chur nas luaithe de làraichean QB RC-LH114-W, cineatics quinone nas luaithe anns a’ cho-thàthadh, agus barrachd coltachd gun tèid iad tarsainn air lùb LH1. Tha sinn a’ moladh gum faodadh dìth UQ ann an làrach RC QB RC-LH114-W a bhith mar thoradh air co-thàthadh nas iom-fhillte agus nas gnìomhaiche, agus gu bheil làrach QB RC-LH114-W air a reothadh sa bhad ann an tionndadh UQ. Tha an ìre shònraichte (chaidh an t-slighe a-steach don làrach QB a dhùnadh) a’ nochdadh co-chruth na gnìomhachd seo.
Às aonais QB, bidh an rothladh co-cheangailte de L-Phe217 gu suidheachadh nach eil co-chòrdail ri ceangal UQ10, oir bidh e ag adhbhrachadh bualadh fànais leis a’ chiad aonad isoprene den earball (Figear 6A). A bharrachd air an sin, tha na prìomh atharrachaidhean cumadh follaiseach follaiseach, gu sònraichte an helix de (helix goirid anns a’ lùb eadar TMH D agus E) far a bheil L-Phe217 air a ghluasad chun phòcaid ceangail QB agus rothladh L-Tyr223 (Figear 6A) gus am ceangal haidridean leis a’ chreat-obrach M-Asp45 a bhriseadh agus beul làrach ceangail QB a dhùnadh (Figear 6B). Bidh an helix de a’ pivotadh aig a bhonn, tha Cα L-Ser209 air a ghluasad le 0.33 Å, agus tha L-Val221Cα air a ghluasad le 3.52 Å. Chan eil atharrachaidhean sam bith ri fhaicinn ann an TMH D agus E, a tha air an cur thairis anns an dà structar (Figear 6A). Cho fad ’s as aithne dhuinn, ’s e seo a’ chiad structar anns an RC nàdarra a dhùineas an làrach QB. Tha coimeas leis an structar iomlan (ceangailte ri QB) a’ sealltainn, mus tèid an quinone a lughdachadh, gu bheil feum air atharrachadh cumadh gus a dhol a-steach don quinone. Bidh L-Phe217 a’ tionndadh gus eadar-obrachadh cruachadh-π a chruthachadh leis a’ bhuidheann-cinn quinone, agus bidh an helix a’ gluasad a-mach, a’ leigeil le cnàimhneach L-Gly222 agus slabhraidh taobh L-Tyr223 lìonra ceangail haidridean a chruthachadh le structar ceangail haidridean seasmhach (Figear 6, A agus C).
(A) Cartùn a’ dol thairis air a chèile de structar hologram (slabhraidh L, slabhraidh orains/slabhraidh M, magenta) agus apo (liath), anns a bheil na prìomh fhuigheallan air an taisbeanadh ann an cruth riochdachaidh coltach ri slat. Tha UQ10 air a riochdachadh le bàr buidhe. Tha an loidhne dhotagach a’ comharrachadh nan ceanglaichean haidridean a chaidh a chruthachadh anns an structar gu lèir. (B agus C) Riochdachadh uachdar an apolipoprotein agus an structar fàinne gu lèir, a’ soilleireachadh ocsaidean slabhraidh taobh L-Phe217 ann an gorm agus L-Tyr223 ann an dearg, fa leth. Tha an fho-aonad L orains; chan eil na fo-aonadan M agus H air an dath. (D agus E) Làraichean apolipoprotein (D) agus slàn (E) RC QB [dath le (A) fa leth] agus Thermophilus thermophilus PSII (uaine, gorm le quinone plastaig; PDB ID: 3WU2) Co-thaobhadh (58).
Gu h-obann, ged a tha grunn structaran de RCan easbhaidheach QB às aonais LH1 rim faighinn, cha deach na h-atharrachaidhean cumadh a chaidh fhaicinn san sgrùdadh seo aithris roimhe. Tha iad sin a’ toirt a-steach structar crìonadh QB bho Blc. viridis (PDB ID: 3PRC) (27), Tch. tepidum (PDB ID: 1EYS) (28) agus Rba. sphaeroides (PDB ID: 1OGV) (29), agus tha iad uile cha mhòr an aon rud ris an structar QB iomlan aca. Nochd sgrùdadh dlùth air 3PRC gu bheil moileciuilean inneal-glanaidh LDAO (Lauryl Dimethyl Amine Oxide) a’ ceangal aig beul suidheachadh QB, a dh’ fhaodadh casg a chuir air ath-eagrachadh gu cumadh dùinte. Ged nach eil LDAO a’ lobhadh aig an aon suidheachadh ann an 1EYS no 1OGV, tha na RCan sin air an ullachadh a’ cleachdadh an aon inneal-glanaidh agus mar sin faodaidh iad an aon bhuaidh a thoirt gu buil. Structar criostail Rba. Tha coltas gu bheil làrach QB dùinte aig Sphaeroides RC air a cho-chriostalachadh le cytochrome c2 (PDB ID: 1L9B) cuideachd. Ach, sa chùis seo, tha an roinn N-criochnach den polypeptide RC-M (ag eadar-obrachadh leis an làrach ceangail QB tron ​​cheangal H den fhuigheall Tyr air an helix Q) a’ gabhail ri cumadh mì-nàdarrach, agus chan eil an t-atharrachadh cumadh QB air a sgrùdadh tuilleadh (30). Is e an rud a tha misneachail nach fhaca sinn an seòrsa deformachadh seo den polypeptide M ann an structar RC-LH114-W, a tha cha mhòr an aon rud ris an roinn N-criochnach de RC-LH116 RC. Bu chòir a thoirt fa-near cuideachd, às deidh cuir às don antenna LH1 stèidhichte air inneal-glanaidh, gun deach na RCan apolipoprotein anns a’ PDB a rèiteachadh, a chuir às do na linneachan quinone a-staigh agus na lipids anns a’ bheàrn eadar an RC agus uachdar a-staigh fàinne LH1 mun cuairt (31, 32). Tha RC fhathast obrachail leis gu bheil e a’ cumail a h-uile co-fhactar, ach a-mhàin an quinone QB a ghabhas lobhadh, nach eil cho seasmhach agus a thèid a chall gu tric rè a’ phròiseas ullachaidh (33). A bharrachd air an sin, tha fios gum faod toirt air falbh LH1 agus lipidean cearcallach nàdarra bho RC buaidh a thoirt air gnìomhan, leithid fad-beatha nas giorra an stàit P+QB air a sgaradh le luchdan (31, 34, 35). Mar sin, tha sinn a’ beachdachadh gum faodadh làthaireachd fàinne LH1 ionadail timcheall air an RC an làrach QB “dùinte” a chumail suas, agus mar sin an àrainneachd ionadail faisg air a’ QB a ghleidheadh.
Ged nach eil apolipoprotein (às aonais quinone QB) agus an structar iomlan a’ riochdachadh ach dà dhealbh-sgrìn de thionndadh làrach QB, seach sreath de thachartasan, tha comharran ann gum faodar an ceangal a gheatadh gus casg a chuir air ath-cheangal le hydroquinone gus casg a chuir air casg an t-substrate. Is dòcha gu bheil eadar-obrachadh quinolol agus quinone faisg air làrach QB apolipoprotein eadar-dhealaichte, a tha ag adhbhrachadh gu bheil RC ga dhiùltadh. Tha e air a bhith air a mholadh o chionn fhada gu bheil atharrachaidhean cumadh a’ cluich pàirt ann an ceangal agus lughdachadh quinones. Tha comas RCan reòta quinones a lughdachadh às deidh atharrachadh dorcha air a lagachadh (36); Tha criostalagrafaireachd X-ghath a’ sealltainn gu bheil an milleadh seo mar thoradh air quinones QB a bhith glaiste ann an cumadh “distal” mu 4.5 Å bhon t-suidheachadh proximal gnìomhach (26), 37). Tha sinn a’ moladh gur e dealbh-sgrìn den staid eadar-mheadhanach eadar apolipoprotein agus an structar fàinne slàn a th’ anns a’ chumadh ceangail distal seo, a leanas an eadar-obrachadh tùsail le quinone agus fosgladh làrach QB.
Tha glèidhteachas structarail is gnìomhach aig an RC seòrsa II a lorgar ann an co-thàthadh PSII cuid de bacteria fototrofach is cyanobacteria, algaich is lusan (38). Tha an co-thaobhadh structarail a chithear ann am Figear 6 (D agus E) a’ cur cuideam air cho coltach ‘s a tha RCan PSII agus làrach QB a’ cho-thàthaidh RC bacteriach. Tha an coimeas seo air a bhith na mhodail airson ùine mhòr airson sgrùdadh a dhèanamh air na siostaman dlùth-cheangailte de cheangal is lughdachadh quinone. Mhol foillseachaidhean roimhe gu bheil atharrachaidhean co-dhealbhach an cois lughdachadh PSII de quinones (39, 40). Mar sin, a’ beachdachadh air glèidhteachas mean-fhàsach RC, is dòcha gu bheil an dòigh ceangail seo nach fhacas roimhe seo iomchaidh cuideachd airson làrach QB de RC PSII ann an lusan fototrofach ocsaideanaichte.
Seòrsachan Rps ΔpufW (sguabadh às pufW gun leubail) agus PufW-His (pròtain-W le tagaichean His 10x aig C-terminal air a chur an cèill bhon locus pufW nàdarra). Chaidh palustris CGA009 a mhìneachadh san obair roimhe againn (16). Chaidh na seòrsachan seo agus am pàrant fiadhaich isogenic fhaighinn air ais bhon reothadair le bhith a’ cur àireamh bheag de cheallan air truinnsear PYE (gach 5 g liotair -1) (air a stòradh ann an LB aig -80 °C, anns a bheil 50% (w/v) glycerol) pròtain, earrann beirm agus succinate) agar [1.5% (w/v)]. Chaidh am truinnsear a ghoir thar oidhche anns an dorchadas aig teòthachd an t-seòmair fo chumhachan anaerobic, agus an uairsin air a shoillseachadh le solas geal (~50 μmolm-2 s-1) air a thoirt seachad le bulbaichean halogen OSRAM 116-W (RS Components, RA) airson 3 gu 5 latha gus an nochd aon choloinidh. Chaidh aon choloinidh a chleachdadh gus 10 ml de mheadhan M22+ (41) a chur ann an lionn, air a neartachadh le 0.1% (w/v) de chasamino-aigéid (ris an canar M22 an-seo às dèidh seo). Chaidh an cultar fhàs fo chumhachan ocsaidean ìosal anns an dorchadas aig 34°C le crathadh aig 180 rpm airson 48 uairean, agus an uairsin chaidh 70 ml den chultar a chur ann an lionn fo na h-aon chumhachan airson 24 uairean. Tha cultar leth-aerobic le tomhas-lìonaidh de 1 ml air a chleachdadh gus 30 ml de mheadhan M22 a chur ann am botal glainne follaiseach le mullach sgriubha uile-choitcheann 30 ml agus air a rèididheachd le gluasad (~50μmolm-2 s-1) airson 48 uairean le slat-ghluasad feachd magnetach sterile. An uairsin chaidh 30 ml den chultar a chur ann an lionn le mu 1 liotair de chultar fo na h-aon chumhachan, agus an uairsin chaidh an cultar a chleachdadh gus mu 9 liotairean de chultar air a shoilleireachadh aig ~200 μmolm-2 s-1 a chur ann an lionn airson 72 uairean. Chaidh na ceallan a bhuain le bhith gan cur ann an ceud-shreafachadh aig 7132 RCF airson 30 mionaid, an uair sin gan crochadh a-rithist ann an ~10 ml de 20 mM tris-HCl (pH 8.0), agus an stòradh aig -20°C gus an robh feum orra.
Às dèidh leaghadh, cuir criostalan de deoxyribonuclease I (Merck, RA), lysozyme (Merck, RA) agus dà chlàr Roche holoenzyme protease inhibitor (Merck, RA) ris na ceallan ath-fhuaraichte. Ann an cealla cuideam Frangach 20,000 psi (Aminco, USA), chaidh na ceallan a bhriseadh 8 gu 12 uair. Às dèidh ceallan neo-bhriste agus sprùilleach neo-sholabailte a thoirt air falbh le bhith gan cur ann an ceud-fhuarachadh aig 18,500 RCF airson 15 mionaidean aig 4°C, chaidh am membran a dhòrtadh a-mach às an lysate dathte le bhith gan cur ann an ceud-fhuarachadh aig 113,000 RCF airson 2 uair a thìde aig 43,000°C. Tilg air falbh am pàirt a tha so-sgaoilte agus ath-fhuarachadh am membran dathte ann an 100 gu 200 ml de 20 mM tris-HCl (pH 8.0) agus dèan co-chothromachadh gus nach bi cruinneachaidhean rim faicinn. Chaidh am membran crochte a ghoir ann an 20 mM tris-HCl (pH 8.0) (Anatrace, USA) anns an robh 2% (w/v) β-DDM airson 1 uair anns an dorchadas aig 4°C le measgachadh socair. An uairsin cuir ann an centrifuge aig 70°C gus 150,000 RCF a sgaoileadh aig 4°C airson 1 uair gus na stuthan neo-sholubhail a bha air fhàgail a thoirt air falbh.
Chaidh am membran solubilachaidh bhon t-sreabh ΔpufW a chur air colbh iomlaid ian DEAE Sepharose 50 ml le trì tomhas-lìonaidh colbh (CV) de bufair ceangail [20 mM tris-HCl (pH 8.0) anns a bheil 0.03% (w / v) β-DDM]. Nigh an colbh le dà bufair ceangail CV, agus an uairsin nigh an colbh le dà bufair ceangail anns a bheil 50 mM NaCl. Chaidh an co-thàth RC-LH116 a dhì-shlaodadh le caisead loidhneach de 150 gu 300 mM NaCl (ann am bufair ceangail) air 1.75 CV, agus chaidh an co-thàth ceangail a bha air fhàgail a dhì-shlaodadh le bufair ceangail anns a bheil 300 mM NaCl air 0.5 CV. Cruinnich an speactram glacaidh eadar 250 agus 1000 nm, cùm am bloigh le co-mheas glacaidh (A880/A280) nas motha na 1 aig 880 gu 280 nm, caolaich e dà uair anns a’ bhufair ceangail, agus cleachd an aon mhodh-obrach a-rithist air colbh DEAE On purification. Caolaich na bloigh le co-mheasan A880/A280 nas àirde na 1.7 agus co-mheasan A880/A805 nas àirde na 3.0, dèan an treas cuairt de iomlaid ian, agus cùm bloigh le co-mheasan A880/A280 nas àirde na 2.2 agus co-mheasan A880/A805 nas àirde na 5.0. Chaidh an co-thàthadh a chaidh a ghlanadh gu ìre a dhùmhlachadh gu ~2 ml ann an criathrag ceud-fhulangach Amicon 100,000 le gearradh-dheth cuideam moileciuil (MWCO) (Merck, RA), agus a luchdachadh air colbh eisgeachd meud Superdex 200 16/600 (GE Healthcare, na SA) anns an robh bufair 200 mM NaCl, agus an uairsin a dh’eluadh san aon bufair aig 1.5 CV. Cruinnich na speactra glacaidh den chuibhreann eisgeachd meud, agus dùmhlaich na speactra glacaidh le co-mheasan A880/A280 os cionn 2.4 agus co-mheasan A880/A805 os cionn 5.8 gu 100 A880, agus cleachd iad sa bhad airson ullachadh no stòradh griod crio-TEM. Cùm aig -80°C gus an tèid feum air.
Chaidh am membran solubilachaidh bhon t-sreang PufW-His a chur air colbh 20 ml HisPrep FF Ni-NTA Sepharose (20 mM tris-HCl (pH 8.0) anns a bheil 200 mM NaCl agus 0.03% (w/w)) ann am bufair IMAC (GE Healthcare). (v) β-DDM]. Chaidh an colbh a nighe le còig CVan de bufair IMAC, agus an uairsin le còig CVan de bufair IMAC anns a bheil 10 mM histidine. Chaidh an co-thàthadh cridhe a thoirt a-mach às a’ cholbh le còig bufairean IMAC anns a bheil 100 mM histidine. Tha am pàirt anns a bheil an co-thàthadh RC-LH114-W air a dhùmhlachadh gu ~10 ml ann an tanca measgaichte uidheamaichte le criathrag Amicon 100,000 MWCO (Merck, RA), air a lagachadh 20 uair le bufair ceangail, agus an uairsin air a chur ri 25 ml. Anns a’ cholbh DEAE Sepharose, thathas a’ cleachdadh ceithir CVan ceangailte ris a’ bufair ro-làimh. nigh an colbh le ceithir bufairean ceangail CV, an uairsin cuir às don cho-thàthadh air ochd CVn air caisead loidhneach de 0 gu 100 mM NaCl (ann am bufair ceangail), agus na ceithir CVn a tha air fhàgail anns a bheil bufair ceangail 100 mM. Chaidh na co-thàthaidhean a bha air fhàgail a chaidh a chuir às don chlòraid sodium còmhla ris a’ cho-mheas A880/A280 nas àirde na 2.4 agus a’ cho-mheas A880/A805 nas àirde na bloighean 4.6 a dhùmhlachadh gu ~2 ml ann an criathrag ceud-ghluasadach Amicon 100,000 MWCO, agus lìonadh le 1.5 CV IMAC ro-làimh. Colbh eisgeachd meud Superdex 200 16/600 air a chothromachadh le bufair, agus an uairsin air a chuir às don aon cho-thàthadh thairis air 1.5 CV. Cruinnich speactraman glacaidh nam bloighean meud-dùnaidh agus dùmhlaich na speactraman glacaidh le co-mheasan A880/A280 os cionn 2.1 agus co-mheasan A880/A805 os cionn 4.6 gu 100 A880, a thèid a chleachdadh sa bhad airson ullachadh griod TEM reòta no a stòradh aig -80°C gus am bi feum orra.
Chaidh reothadair bogaidh Leica EM GP a chleachdadh gus griodan TEM aig teòthachd ìosal ullachadh. Chaidh an co-thàthadh a lagachadh ann am bufair IMAC gu A880 de 50, agus an uairsin chaidh 5μl a luchdachadh air mogaill copair còmhdaichte le gualain QUANTIFOIL 1.2/1.3 a chaidh a leigeil ma sgaoil le deàrrsadh (Agar Scientific, RA) a bha ùr-sgaoilte le deàrrsadh. Goir a’ ghriod aig 20°C agus 60% taiseachd coimeasach airson 30 diogan, an uairsin tiormaich e airson 3 diogan, agus an uairsin cuir às dha ann an ethane leaghte aig -176°C.
Chaidh dàta an iom-fhillte RC-LH114-W a chlàradh air an eBIC (Ionad Bith-ìomhaighean Eileagtronaigeach) (British Diamond Light Source) le miocroscop Titan Krios, a bhios ag obair aig bholtaids luathachaidh de 300kV, le meudachadh ainmichte de 130,000× agus lùth de - Tagh beàrn de 20 eV. Chaidh Gatan 968 GIF Quantum le lorgaire mullaich K2 a chleachdadh gus ìomhaighean a chlàradh ann am modh cunntaidh gus dàta a chruinneachadh. Is e 1.048 Å meud a’ phiotsagail chalabraichte, agus is e 3.83 e-Å-2s-1 an ìre dòs. Chaidh am film a chruinneachadh ann an 11 diogan agus a roinn ann an 40 pàirt. Cleachd an raon còmhdaichte le carbon gus am miocroscop ath-fhòcasachadh, agus an uairsin cruinnich trì filmichean gach toll. Gu h-iomlan, chaidh 3130 film a chruinneachadh, le luachan dì-fhòcas eadar -1 agus -3μm.
Chaidh an dàta airson an iom-fhillte RC-LH116 a chruinneachadh leis an aon mhicreasgòp aig Obair-lann Bith-structair Asterbury (Oilthigh Leeds, RA). Chaidh an dàta a chruinneachadh ann am modh cunntaidh le meudachadh de 130 k, agus chaidh meud a’ phicteil a chalabrachadh gu 1.065 Å le dòs de 4.6 e-Å-2s-1. Chaidh am film a chlàradh ann an 12 diogan agus a roinn ann an 48 pàirtean. Gu h-iomlan, chaidh 3359 film a chruinneachadh, le luachan dì-fhòcas eadar -1 agus -3μm.
Tha a h-uile giullachd dàta air a dhèanamh ann am pìob-loidhne Relion 3.0 (42). Cleachd Motioncorr 2 (43) gus gluasad a’ ghatha a cheartachadh le cuideam dòs, agus an uairsin cleachd CTFFIND 4.1 (44) gus am paramadair CTF (gnìomh gluasaid eadar-dhealachaidh) a dhearbhadh. Tha dealbhan-micro-dhealbhan àbhaisteach às dèidh nan ìrean giullachd tùsail seo air an sealltainn ann am Figear 2. S16. Tha an teamplaid taghaidh fèin-ghluasadach air a chruthachadh le bhith a’ taghadh le làimh mu 250 piogsail de 1000 gràin ann am frèam 250-piogsail agus gun seòrsachadh dà-thaobhach (2D) iomraidh, agus mar sin a’ diùltadh nan seòrsachadh sin a choinnicheas ri truailleadh sampall no aig nach eil feartan follaiseach. An uairsin, chaidh taghadh fèin-ghluasadach a dhèanamh air na micro-dhealbhan uile, agus b’ e 849,359 gràin an RC-LH114-W, agus b’ e 476,547 gràin an co-thàthadh RC-LH116. Tha na gràineanan taghte uile air a dhol tro dhà chuairt de sheòrsachadh 2D neo-iomraidh, agus an dèidh gach ruith, thèid na gràineanan a choinnicheas ris an raon gualain, truailleadh an t-sampall, gun fheartan follaiseach no gràineanan a tha a’ dol thairis air a chèile gu làidir a dhiùltadh, agus mar thoradh air sin tha 772,033 (90.9%) agus 359,678 (75.5%) de na gràineanan air an cleachdadh airson seòrsachadh 3D de RC-LH114-W agus RC-LH116 fa leth. Chaidh a’ chiad mhodail iomraidh 3D a chruthachadh a’ cleachdadh an dòigh teàrnadh gradient stocastic. A’ cleachdadh a’ chiad mhodail mar iomradh, tha na gràineanan taghte air an seòrsachadh ann an ceithir roinnean ann an 3D. A’ cleachdadh a’ mhodail san roinn seo mar iomradh, dèan grinneachadh 3D air na gràineanan san roinn as motha, an uairsin cleachd an criathrag ìosal-pas 15Å tùsail gus an raon fuasglaiche a chòmhdach, cuir 6 piogsail de oirean bog ris, agus iar-phròiseas na piogsail gus gnìomh gluasaid modulachaidh mullach Gatan K2 den lorgaire as àirde a cheartachadh. Airson an t-seata dàta RC-LH114-W, chaidh am modail tùsail seo atharrachadh le bhith a’ toirt air falbh an dùmhlachd làidir aig oirean a’ mhasg (neo-cheangailte bhon dùmhlachd iom-fhillte cridhe ann an UCSF Chimera). Tha na modailean a thig às (tha rùintean RC-LH114-W agus RC-LH116 3.91 agus 4.16 Å, fa leth) air an cleachdadh mar iomradh airson an dàrna cuairt de sheòrsachadh 3D. Tha na gràineanan a chaidh a chleachdadh air an cruinneachadh sa chlas 3D tùsail agus chan eil ceangal làidir aca ris an nàbachd. For-chòmhdach no dìth fheartan structarail follaiseach. Às deidh an dàrna cuairt de sheòrsachadh 3D, chaidh an roinn leis an rùn as àirde a thaghadh [Airson RC-LH114-W, is e aon roinn 377,703 gràineanan (44.5%), airson RC-LH116, tha dà roinn ann, le 260,752 gràineanan san iomlan (54.7%), far a bheil iad mar an ceudna dìreach nuair a tha iad air an co-thaobhadh às deidh a’ chiad rothlachaidh le eadar-dhealachadh beag]. Tha na mìrean taghte air an ath-tharraing a-mach ann am bogsa 400-piogsail agus air an grinneachadh le grinneachadh 3D. Tha am masg fuasglaiche air a chruthachadh a’ cleachdadh an criathrag pas-ìosal 15Å tùsail, leudachadh mapa 3 piogsail agus masg bog 3 piogsail. A’ cleachdadh grinneachadh CTF gach mìrean, ceartachadh gluasad gach mìrean agus an dàrna cuairt de ghrinneachadh CTF gach mìrean, thèid grinneachadh 3D, masgadh fuasglaiche agus iar-phròiseasadh a dhèanamh às dèidh gach ceum gus an inneach a thig às a ghrinneachadh tuilleadh. A’ cleachdadh luach gearraidh FSC (Fourier Shell Correlation Coefficient) de 0.143, tha rùintean nam modailean deireannach de RC-LH114-W agus RC-LH116 2.65 agus 2.80 Å, fa leth. Tha lùb FSC a’ mhodail dheireannaich air a shealltainn ann am Figear 2. S17.
Tha na sreathan pròtain uile air an luchdachadh sìos bho UniProtKB: LH1-β (PufB; UniProt ID: Q6N9L5); LH1-α (PufA; UniProtID: Q6N9L4); RC-L (PufL; UniProt ID: O83005); RC-M (PufM; UniProt ID: A0A4Z7); RC-H (PuhA; UniProt ID: A0A4Z9); Protein-W (PufW; UniProt ID: Q6N1K3). Chaidh SWISS-MODEL (45) a chleachdadh gus modail co-chosmhail de RC a thogail, anns a bheil sreathan pròtain RC-L, RC-M agus RC-H agus structar criostail Rba. Chaidh sphaeroides RC a chleachdadh mar theamplaid (PDB ID: 5LSE) (46). Cleachd an inneal “mapa iomchaidh” ann an UCSF Chimera gus am modail a chaidh a chruthachadh a chur ris a’ mhapa (47), structar a’ phròtain a leasachadh, agus cleachd an co-fhactar [4 × BChl a (ainm fuigheall leabharlann monomer = BCL), 2 × BPh a (BPH), aon no dhà sheòrsa de UQ10 (U10), aon iarann ​​neo-heme (Fe) agus aon 3,4-dihydrohexacarbonylcholine (QAK)] gus Coot (48) a chur ris. Leis nach eil QAK ri fhaighinn anns an leabharlann monomer, chaidh a pharaimeadarachadh a’ cleachdadh an inneal eLBOW ann am PHENIX (49).
An ath rud, chaidh an fho-aonad LH1 a thogail. An toiseach, chaidh an inneal togail fèin-ghluasadach ann am PHENIX (49) a chleachdadh gus pàirt den t-sreath LH1 a thogail gu fèin-ghluasadach a’ cleachdadh a’ mhapa agus sreathan pròtain LH1-α agus LH1-β mar chur-a-steach. Tagh an fho-aonad LH1 as coileanta, thoir a-mach e agus luchdaich e a-steach do Coot, cuir an t-sreath a tha a dhìth ann le làimh, agus grinneachadh an structar gu lèir le làimh mus cuir thu dà BCls a (BCL) agus spirilloxanthin (CRT) ris [a rèir an Rps buntainneach Dùmhlachd an iom-fhillte LH1 agus an susbaint carotenoid aithnichte. Gnèithean (17)]. Dèan lethbhreac den fho-aonad LH1 gu lèir, agus cleachd “Inneal Mapa Docaidh” UCSF Chimera gus docadh a-steach don raon neo-mhodail faisg air làimh de dhùmhlachd LH1, agus an uairsin grinneachadh e ann an Coot; ath-aithris am pròiseas gus am bi na fo-aonadan LH1 uile air am modaladh. Airson structar RC-LH114-W, le bhith a’ toirt a-mach an dùmhlachd neo-riaraichte anns a’ Coot, tha am pròtain air a roinn bho na co-phàirtean neo-phròtain a tha air fhàgail ann am mapa Chimera USCF agus tha an inneal Autobuild air a chleachdadh gus am modail tùsail, agus na fo-aonadan a tha air fhàgail (pròtain-W) a stèidheachadh. Ann am PHENIX (49). Cuir sreathan sam bith a tha a dhìth ris a’ mhodail a thig às ann an Coot (48), agus an uairsin leasaich an fho-aonad gu lèir le làimh. Bidh an dùmhlachd neo-riaraichte a tha air fhàgail a’ freagairt air measgachadh de lipidean (ID leabharlann monomer PDB de CDL = CDL, POPC = 6PL agus POPG = PGT), inneal-glanaidh β-DDM (LMT) agus moileciuilean UQ10 (U10). Cleachd leasachadh PHENIX (49) agus leasachadh làimhe ann an Coot (48) gus am modail tùsail iomlan a dhèanamh foirfe gus nach gabh staitistig a’ mhodail agus càileachd lèirsinneach an fhreagarrachd a leasachadh tuilleadh. Mu dheireadh, cleachd LocScale (50) gus am mapa ionadail a gheurachadh, agus an uairsin dèan grunn chuairtean eile de mhodaileadh an dùmhlachd neo-riaraichte agus leasachadh fèin-ghluasadach agus làimhe.
Tha na peptidean, na co-fhactaran agus na lipidean is na quinones eile a tha ceangailte ri chèile taobh a-staigh an dùmhlachdan fa leth air an sealltainn ann am Figearan 1 agus 2. S18 gu S23. Tha am fiosrachadh staitistigeil mun mhodail dheireannaich air a shealltainn ann an Clàr S1.
Mura h-eilear ag ràdh a chaisead, chaidh na speactra glacaidh UV/Vis/NIR a chruinneachadh air speactrofotomeatair Cary60 (Agilent, USA) aig eadar-amaichean 1 nm bho 250 nm gu 1000 nm agus ùine amalachaidh de 0.1s.
Caolaich an sampall ann an cuvette grian-chlach le slighe 2 mm gu A880 de 1, agus cruinnich an speactram sùghaidh eadar 400 agus 1000 nm. Chaidh na speactraman dichroic cruinn a chruinneachadh air speactropolarimeter Jasco 810 (Jasco, Iapan) aig eadar-amaichean 1 nm eadar 400 nm agus 950 nm aig ìre sganaidh de 20 nm min-1.
Tha an co-èifeachd cuir às molar air a dhearbhadh le bhith a’ lagachadh a’ cho-thàthaidh chridhe gu A880 de mu 50. Lagachadh an tomhas-lìonaidh 10μl ann am bufair ceangail 990μl no methanol, agus cruinnich an speactram gabhail sa bhad gus crìonadh BChl a lughdachadh. Chaidh susbaint BChl gach sampall methanol obrachadh a-mach leis a’ cho-èifeachd cuir às aig 771 nm de 54.8 mM-1 cm-1, agus chaidh an co-èifeachd cuir às a dhearbhadh (51). Roinn dùmhlachd BChl a chaidh a thomhas le 32 (RC-LH114-W) no 36 (RC-LH116) gus dùmhlachd a’ cho-thàthaidh chridhe a dhearbhadh, a thathas an uairsin a’ cleachdadh gus speactram gabhail an aon sampall a chaidh a chruinneachadh anns a’ bhufair co-shìnte a dhearbhadh. Chaidh trì tomhasan ath-aithris a dhèanamh airson gach sampall, agus chaidh gabhail cuibheasach an ìre as àirde de BChl Qy a chleachdadh airson an àireamhachadh. Is e 3280 ± 140 mM-1 cm-1 an co-èifeachd cuir às aig RC-LH114-W air a thomhas aig 878 nm, agus is e 3800 ± 30 mM-1 cm-1 an co-èifeachd cuir às aig RC-LH116 air a thomhas aig 880 nm.
Chaidh UQ10 a thomhas a rèir an dòigh ann an (52). Ann an ùine ghoirid, chaidh HPLC ìre-aiseig (RP-HPLC) a dhèanamh a’ cleachdadh siostam Agilent 1200 HPLC. Leagh mu 0.02 nmol de RC-LH116 no RC-LH114-W ann an 50μl de 50:50 methanol:cloroform anns a bheil 0.02% (w/v) clòraid ferric, agus stealladh an Beckman Coulter Ultrasphere ODS 4.6 mm ro-chothromaichte ann an 1 ml-1 min-1 aig 40°C ann an fhuasglaiche HPLC (80:20 methanol:2-propanol) air colbh ×25 cm. Dèan elution isocratach ann am fuasglaiche HPLC gus sùil a chumail air absorbance aig 275 nm (UQ10), 450 nm (carotenoids) agus 780 nm (BChl) airson 1 uair a thìde. Chaidh am bàrr anns a’ chromatagram 275 nm aig 25.5 mionaidean a thoirt a-steach, agus cha robh todhar sam bith eile ann a ghabhadh a lorg. Tha an raon amalaichte air a chleachdadh gus meud molar UQ10 a chaidh a thoirt a-mach obrachadh a-mach a thaobh a’ lùb chalabrachaidh a chaidh a thomhas bho stealladh inbhean fìor-ghlan bho 0 gu 5.8 nmol (Figear S14). Chaidh gach sampall a sgrùdadh ann an trì ath-aithrisean, agus tha am mearachd a chaidh aithris a’ freagairt ris an SD den chuibheasachd.
Chaidh fuasgladh anns an robh an co-thàthadh RC-LH1 le gabhail Qy as àirde de 0.1 ullachadh le 30 μM cytochrome c2 cridhe each lùghdaichte (Merck, RA) agus 0 gu 50 μMUQ2 (Merck, RA). Chaidh trì sampallan 1-ml ullachadh aig gach dùmhlachd UQ2 agus chaidh an goir thar oidhche anns an dorchadas aig 4°C gus dèanamh cinnteach gun robh e ag atharrachadh gu tur ris an dorchadas mus deach an tomhas. Chaidh am fuasgladh a luchdachadh a-steach do speactrofotomeatair modúlach OLIS RSM1000 uidheamaichte le grèata loidhne lasair/500 300 nm, beul a-steach 1.24 mm, meadhan 0.12 mm agus sliotan toraidh 0.6 mm. Tha criathrag pas 600 nm a dh'fhaid air a chuir aig beul an tiùba-dhealbhan sampall agus an tiùb iomadachaidh-dhealbhan iomraidh gus solas brosnachaidh a dhùnadh a-mach. Chaidh an gabhail a-steach a sgrùdadh aig 550 nm le ùine amalachaidh de 0.15 s. Tha an solas brosnachaidh air a sgaoileadh bhon LED 880 nm M880F2 (Light Emitting Diode) (Thorlabs Ltd., RA) tro chàball snàithleach optaigeach aig dian 90% tro rianadair DC2200 (Thorlabs Ltd., RA) agus air a sgaoileadh chun stòr solais aig ceàrn 90°. Tha am beam tomhais mu choinneamh an sgàthan gus solas sam bith nach deach a ghabhail a-steach leis an sampall an toiseach a thilleadh. Cùm sùil air an gabhail a-steach 10 diogan mus tig an soillseachadh gu 50 diogan. An uairsin chaidh sùil a chumail air an gabhail a-steach airson 60 diogan anns an dorchadas gus measadh a dhèanamh air an ìre gu bheil quinolol a’ lughdachadh cytochrome c23+ gu fèin-ghluasadach (faic Figear S8 airson dàta amh).
Chaidh an dàta a phròiseasadh le bhith a’ freagairt ìre tòiseachaidh loidhneach taobh a-staigh 0.5 gu 10 diogan (a rèir dùmhlachd UQ2) agus a’ faighinn cuibheasachd de na h-ìrean airson nan trì sampallan aig gach dùmhlachd UQ2. Chaidh dùmhlachd RC-LH1, air a thomhas leis a’ cho-èifeachd cuir às fa leth, a chleachdadh gus an ìre a thionndadh gu èifeachdas catalaíoch, air a phlòtadh ann an Origin Pro 2019 (OriginLab, USA), agus air a freagairt ris a’ mhodail Michaelis-Menten gus na luachan follaiseach Km agus Kcat a dhearbhadh.
Airson tomhais glacaidh sealach, chaidh an sampall RC-LH1 a lagachadh gu ~2μM ann am bufair IMAC anns an robh 50 mM sodium ascorbate (Merck, USA) agus 0.4 mM Terbutin (Merck, USA). Tha searbhag ascorbic air a chleachdadh mar thabhartaiche electron ìobairteach, agus tha tert-butaclofen air a chleachdadh mar bhacadh QB gus dèanamh cinnteach gu bheil am prìomh thabhartaiche RC air a lughdachadh (is e sin, gun a bhith air a photooxidachadh) tron ​​phròiseas tomhais. Tha timcheall air 3 ml den t-sampall air a chur ri cealla rothlach gnàthaichte (timcheall air 0.1 m ann an trast-thomhas, 350 RPM) le fad slighe optigeach 2 mm gus dèanamh cinnteach gu bheil ùine gu leòr aig an sampall anns an t-slighe laser airson atharrachadh dorcha eadar cuislean brosnachaidh. Cleachd cuislean laser ~100-fs gus an siostam laser Ti: Sapphire (Spectra Physics, USA) a mheudachadh gus an sampall a bhrosnachadh aig 880 nm aig ìre ath-aithris de 1 kHz (20 nJ airson NIR no 100 nJ airson Vis). Mus tèid dàta a chruinneachadh, cuir an sampall fo sholas brosnachaidh airson timcheall air 30 mionaid. Bheir nochdadh neo-ghnìomhachd QA (’s dòcha a’ lughdachadh QA aon no dhà uair). Ach thoir an aire gu bheil am pròiseas seo comasach air ais-thionndadh oir às dèidh ùine fhada de dh’atharrachadh dorcha, tillidh RC mean air mhean gu gnìomhachd QA. Chaidh speactrometer Helios (Ultrafast Systems, USA) a chleachdadh gus speactraman sealach a thomhas le ùine dàil de -10 gu 7000 ps. Cleachd bathar-bog Surface Xplorer (Ultrafast Systems, USA) gus na seataichean dàta a dhì-bhuidhneachadh, an uairsin an co-chur agus an daingneachadh. Cleachd am pasgan bathar-bog CarpetView (Light Conversion Ltd., Liotuàinia) gus an seata dàta còmhla a chleachdadh gus speactraman eadar-dhealaichte fhaighinn co-cheangailte ri lobhadh, no cleachd gnìomh a bhios a’ co-chruinneachadh iomadh eas-chruthach le freagairt an ionnstramaid gus a bhith iomchaidh airson mean-fhàs speactramach aon-tonn-fhaid ann an Origin (OriginLab, USA).
Mar a chaidh ainmeachadh gu h-àrd (53), chaidh film foto-cho-chur anns an robh co-thàthadh LH1 às aonais antenna RC agus LH2 iomaill ullachadh. Chaidh am membran a lagachadh ann an 20 mM tris (pH 8.0) agus an uairsin a luchdachadh a-steach do cuvette grian-chlach le slighe optigeach 2 mm. Chaidh cuisle laser 30nJ a chleachdadh gus an sampall a bhrosnachadh aig 540 nm le ùine dàil de -10 gu 7000 ps. Giullachd an seata dàta mar a chaidh a mhìneachadh airson sampall Rps. pal.
Chaidh am membran a dhèanamh na pheilearan le bhith ga centrifugachadh aig 150,000 RCF airson 2 uair a thìde aig 4°C, agus an uairsin chaidh a ghabhail a-steach aig 880 nm ath-fhulang ann an 20 mM tris-HCl (pH 8.0) agus 200 mM NaCl. Leagh am membran le bhith ga mheasgachadh gu slaodach ann an 2% (w/v) β-DDM airson 1 uair a thìde anns an dorchadas aig 4°C. Chaidh an sampall a lagachadh ann an 100 mM triethylammonium carbonate (pH 8.0) (TEAB; Merck, RA) gu dùmhlachd pròtain de 2.5 mg ml-1 (mion-sgrùdadh Bio-Rad). Chaidh tuilleadh giollachd a dhèanamh bhon dòigh a chaidh fhoillseachadh roimhe (54), a’ tòiseachadh le lagachadh 50 μg pròtain gu iomlan de 50 μl TEAB anns a bheil 1% (w/v) sodium laurate (Merck, RA). Às dèidh sonication airson 60 diogan, chaidh a lughdachadh le 5 mM tris(2-carboxyethyl)phosphine (Merck, RA) aig 37°C airson 30 mionaid. Airson S-alkylation, goir an sampall le 10 mM methyl S-methylthiomethanesulfonate (Merck, RA) agus cuir ris e bho fhuasgladh stoc isopropanol 200 mM airson 10 mionaidean aig teòthachd an t-seòmair. Chaidh cnàmhadh proteolytic a dhèanamh le bhith a’ cur 2 μg de mheasgachadh trypsin/endoproteinase Lys-C (Promega RA) ris agus ga ghoir aig 37°C airson 3 uairean a thìde. Chaidh an surfactant laurate a thoirt a-mach le bhith a’ cur 50 μl ethyl acetate agus 10 μl 10% (v/v) searbhag trifluoroacetic ìre LC (TFA; Thermo Fisher Scientific, RA) ris agus ga mheasgachadh le vortex airson 60 diogan. Chaidh an dealachadh ìrean adhartachadh le bhith ga centrifugachadh aig 15,700 RCF airson 5 mionaidean. A rèir protocol an neach-dèanamh, chaidh colbh snìomh C18 (Thermo Fisher Scientific, RA) a chleachdadh gus an ìre ìosal anns an robh am peptide a shùghadh agus a dhì-shalannachadh gu faiceallach. Às dèidh tiormachadh le bhith a’ cur an sampall ann an centrifugation falamh, chaidh a sgaoileadh ann an 0.5% TFA agus 3% acetonitrile, agus chaidh 500 ng a sgrùdadh le cromatagrafaidheachd nanoflow RP còmhla ri speactramaitreachd mais a’ cleachdadh nam paramadairean siostaim a chaidh a mhìneachadh roimhe.
Cleachd MaxQuant v.1.5.3.30 (56) airson comharrachadh agus tomhas phròtainean gus stòr-dàta proteome Rps. palustris a lorg (www.uniprot.org/proteomes/UP000001426). Chaidh dàta proteomics speactramaitreachd mais a thasgadh ann an Caidreachas ProteomeXchange tron ​​stòr-dàta com-pàirtiche PRIDE (http://proteomecentral.proteomexchange.org) fon aithnichear seata dàta PXD020402.
Airson mion-sgrùdadh le RPLC còmhla ri speactramaitreachd mais ianachaidh electrospray, chaidh an co-thàthadh RC-LH1 ullachadh bho Rps fiadhaich. A’ cleachdadh an dòigh a chaidh fhoillseachadh roimhe (16), b’ e 2 mg ml-1 an dùmhlachd pròtain a chaidh a thoirt a-mach ann an ceallan palustris ann an 20 mM Hepes (pH 7.8), 100 mM NaCl agus 0.03% (w/v) β- (mion-sgrùdadh Bio-Rad)) DDM. A rèir protocol an neach-dèanamh, cleachd pasgan glanaidh 2D (GE Healthcare, USA) gus 10 μg pròtain a thoirt a-mach leis an dòigh sileadh, agus sgaoil an sileadh ann an 20 μl 60% (v/v) searbhag formach (FA), 20% (v/v) Acetonitrile agus 20% (v/v) uisge. Chaidh còig microliters a sgrùdadh le RPLC (Dionex RSLC) còmhla ri speactramaitreachd mais (Maxis UHR-TOF, Bruker). Cleachd colbh MabPac 1.2 × 100 mm (Thermo Fisher Scientific, RA) airson dealachadh aig 60 ° C agus 100 μl min -1, le caisead de 85% (v / v) fuasglaiche A [0.1% (v / v) FA agus fuasgladh uisgeach 0.02% (V / v) TFA] gu 85% (v / v) fuasglaiche B [0.1% (v / v) FA agus 0.02% (v / v) ann an 90% (v / v) acetonitrile TFA]. A’ cleachdadh stòr ianachaidh electrospray àbhaisteach agus paramadairean bunaiteach airson còrr is 60 mionaid, gheibh an speactramadair mais 100 gu 2750 m / z (co-mheas mais-gu-luchd). Le cuideachadh bhon inneal FindPept aig portal ghoireasan bith-fhiosrachaidh ExPASy (https://web.expasy.org/findpept/), mapaich an speactram mais gu fo-aonadan a’ cho-thàthaidh.
Chaidh na ceallan fhàs airson 72 uair a thìde fo sholas 100 ml NF-ìosal (10μMm-2 s-1), meadhanach (30μMm-2 s-1) no àrd (300μMm-2 s-1). Meadhan M22 (meadhan M22 anns nach eil ammonium sulfate air a chleachdadh agus sodium succinate air a chur an àite sodium acetate) ann am botal 100 ml le mullach sgriubha (23). Ann an còig cuairtean 30-diog, chaidh grìogagan glainne 0.1 micron a chur ann an grìogagan aig co-mheas meud de 1:1 gus na ceallan a bhriseadh agus an cur ann am fuarachadh air deigh airson 5 mionaidean. Chaidh an stuth neo-sholaisgte, ceallan neo-bhriste agus grìogagan glainne a thoirt air falbh le bhith gan cur ann an ceudrifugation aig 16,000 RCF airson 10 mionaidean ann am microcentrifuge beingidh. Chaidh am membran a sgaradh ann an rotor Ti 70.1 le 100,000 RCF ann an 20 mM tris-HCl (pH 8.0) le caisead siùcros 40/15% (w/w) airson 10 uairean a thìde.
Mar a chaidh a mhìneachadh san obair a bh’ againn roimhe, lorg imdhíonach an taga His air PufW (16). Ann an ùine ghoirid, chaidh an co-thàthadh cridhe glan (11.8 nM) no am membran anns a bheil an aon dùmhlachd de RC (air a dhearbhadh le ocsaidachadh a’ toirt air falbh an speactram eadar-dhealachaidh lùghdaichte agus a’ maidseadh an luchd air a’ ghel dhathte) ann am bufair luchdaidh 2x SDS (Merck, RA) a lagachadh dà uair. Chaidh na pròtainean a sgaradh air gel bis-tris mac-samhail 12% NuPage (Thermo Fisher Scientific, RA). Chaidh gel a dhath le Coomassie Brilliant Blue (Bio-Rad, RA) gus an fho-aonad RC-L a luchdachadh agus a dhèanamh follaiseach. Chaidh am pròtain air an dàrna gel a ghluasad gu membran polyvinylidene fluoride (PVDF) air a ghnìomhachadh le methanol (Thermo Fisher Scientific, RA) airson deuchainn imdhíonach. Chaidh am membran PVDF a bhacadh ann an 50 mM tris-HCl (pH 7.6), 150 mM NaCl, 0.2% (v / v) Tween-20 agus 5% (w / v) pùdar bainne sgimichte, agus an uairsin a ghoir leis a’ phrìomh antibody anti-His (ann an Dilute the antibody buffer [50 mM tris-HCl (pH 7.6), 150 mM NaCl agus 0.05% (v / v) Tween-20] ann an 1:1000 A190-114A, Bethyl Laboratories, USA) airson 4 uairean a thìde. Às dèidh a nighe 3 tursan airson 5 mionaidean ann am bufair antibody, chaidh am membran a chur còmhla ri antibody àrd-sgoile an-aghaidh luchaige peroxidase horseradish (Sigma-Aldrich, RA) (air a lagachadh 1:10,000 ann am bufair antibody). Goir gus leigeil le lorg (5 mionaidean an dèidh 3 nighe ann am bufair antibody) a’ cleachdadh fo-strat chemiluminescence WESTAR ETA C 2.0 (Cyanagen, an Eadailt) agus Amersham Imager 600 (GE Healthcare, RA).
Le bhith a’ tarraing sgaoileadh dian gach sreath gel no immunoassay dhathte, ag amalachadh an raon fon mhullach agus ag obrachadh a-mach co-mheas dian RC-L (gel dhathte) agus Protein-W (immunoassay), ann an ImageJ (57) Pròiseas an ìomhaigh. Chaidh na co-mheasan sin a thionndadh gu co-mheasan molar le bhith a’ gabhail ris gu robh co-mheas RC-L ri protein-W anns an sampall RC-LH114-W fìor-ghlan 1:1 agus a’ gnàthachadh an t-seata dàta gu lèir a rèir sin.
Airson stuthan a bharrachd airson an artaigil seo, faic http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/3/eabe2631/DC1
Is e seo artaigil fosgailte a tha air a sgaoileadh fo chumhachan Ceadachas Attribution Creative Commons. Tha an artaigil a’ ceadachadh cleachdadh, sgaoileadh agus ath-riochdachadh gun bhacadh ann am meadhan sam bith air chumha gu bheil an obair thùsail air a luaidh gu ceart.
Nota: Chan eil sinn ag iarraidh ort ach do sheòladh puist-d a thoirt seachad gus am bi fios aig an neach a tha thu a’ moladh don duilleag gu bheil thu airson gum faic iad am post-d agus nach e spama a th’ ann. Cha ghlac sinn seòlaidhean puist-d sam bith.
Cleachdar a’ cheist seo gus dearbhadh a bheil thu nad neach-tadhail agus gus casg a chuir air spama fèin-ghluasadach.
Daibhidh JK Swainsbury, Pàirc Qian, Philip J. Jackson, Kaitlyn M. Faries, Dariusz M. Niedzwiedzki, Ealasaid C. Màrtainn, Daibhidh A. Farmer, Lorna A. Malone, Rebecca F. Thompson, Neil A. Ranson, Daniel P Canniffe, Mark J. Dickman, Dewey Holten, Christine Kirmaier, Anndra Hitchcock, C. Neil Hunter
Tha structar àrd-rèiteachaidh co-thàthadh ribe solais 1 anns an ionad ath-bhualadh a’ toirt sealladh ùr air daineamaigs quinone.
Daibhidh JK Swainsbury, Pàirc Qian, Philip J. Jackson, Kaitlyn M. Faries, Dariusz M. Niedzwiedzki, Ealasaid C. Màrtainn, Daibhidh A. Farmer, Lorna A. Malone, Rebecca F. Thompson, Neil A. Ranson, Daniel P Canniffe, Mark J. Dickman, Dewey Holten, Christine Kirmaier, Anndra Hitchcock, C. Neil Hunter
Tha structar àrd-rèiteachaidh co-thàthadh ribe solais 1 anns an ionad ath-bhualadh a’ toirt sealladh ùr air daineamaigs quinone.
©2021 Comann Ameireagaidh airson Adhartachadh Saidheans. gach còir glèidhte. Tha AAAS na chom-pàirtiche de HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef agus COUNTER. SaidheansAdvances ISSN 2375-2548.